[0032] 下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
[0033] 实施例1
[0034] 一种用于石油凝聚的胞外多糖的纯化方法，包括以下步骤：
[0035] (1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL。其中，上清液在100℃加热使蛋白变性，便于后续沉淀蛋白，去除蛋白。
[0036] (2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％(低浓度乙醇主要用于去除杂质及蛋白)；用封口膜密封三角瓶口，放置于4℃冰箱中，静置过夜。将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液。
[0037] (3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％(高浓度乙醇用于沉淀多糖)，封口膜密封瓶口，放置于4℃冰箱，静置24h。醇沉24h后三角瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀。
[0038] (4)向溶液中加入0.1％的蛋白酶K(w/v)，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min(Sevage法目的是去掉蛋白)；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。
[0039] (5)将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。
[0040] (5.1)DEAE-52纤维素离子交换层析
[0041] ①DEAE-52纤维素的预处理：取DEAE-52纤维素2.5g，加入到40mL0.5mol/LHCl中，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡30min。加入60mL去离子水，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡10min。倒出上层液体，加入60mL去离子水，搅拌静置后弃上清，重复上述步骤1-2次，然后倾入有100目尼龙滤布的漏斗中。用去离子水充分洗涤，直到流出液pH>4。然后加入40mL 0.5mol/LNaOH浸泡30min后，倾倒上清，用去离子水充分洗涤，直到流出液pH≤3。之后加入100mL 0.01mol/L Na2HPO4浸泡并搅拌，倾去上层液体，重复上述操作，直到溶液pH＝8。
[0042] ②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的DEAE-52纤维素边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后DEAE-52纤维素必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用0.3mol/LNaCl平衡2-3个柱体积即可上样。
[0043] ③上样：加样前，需将柱内DEAE-52纤维素上面多余的液体放出，直到柱内液面与纤维素表面相齐为止。样品上样前需过0.45μm滤膜，上样量为4mL，上样后打开下口开始洗脱。
[0044] ④洗脱：洗脱剂为去离子水、0.3mol/LNaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min，每5mL收集一管，洗脱效果最好。
[0045] ⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分用截留分子量为3500Da的透析袋透析脱盐，第一次隔3h换一次去离子水，之后每隔6h换一次去离子水，重复3～4次。
[0046] 如图1所示，胞外多糖粗提物经过DEAE-52阴离子交换柱层析分离后，由去离子水、0.3mol/LNaCl洗脱分别得到2个组分，命名为EPS1和EPS2。EPS1、EPS2的高效液相色谱图如图2所示。组分EPS1和EPS2未达到对称的单一峰，且EPS2两峰之间未达到较好分离，说明EPS1、EPS2经离子交换层析后并未达到预期的纯度，因此，对这两种胞外多糖还需进行进一步的分离纯化。
[0047] (5.2)凝胶渗透层析
[0048] ①Sephadex G150的预处理：取Sephadex G150凝胶粉8g加入到400mL去离子水中，沸水浴4h，冷却至室温，用去离子水洗涤几次去除杂质，超声脱气。
[0049] ②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的凝胶边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后凝胶必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用NH4HCO3平衡2-3个柱体积即可上样。
[0050] ③上样：加样前，需将柱内凝胶上面多余的液体放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止。取(5.1)分离得到的活性组分过0.45μm滤膜后，上样，上样量为2mL，上样后打开下口开始洗脱。
[0051] ④洗脱：流动相为0.2mol/LNH4HCO3，流速0.2mL/min，每3mL收集一管。
[0052] ⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分旋转蒸发出NH4HCO3并浓缩冻干。如图3所示，EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS1-1。EPS2经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS2-1。
[0053] 组分峰EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析分离后得到组分EPS1-1(6)，采用高效凝胶渗透色谱法对其进行纯度检测，EPS1-1(6)的高效液相色谱图如图4所示，可看出EPS1-1(6)峰型单一且较对称，无杂峰出现，纯度较高。
[0054] 实施例2硫酸-苯酚法测定胞外多糖糖含量
[0055] 分别取500μL浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准葡萄糖溶液，加入200μL 6％苯酚(现配)和1.0mL浓硫酸，混匀后在沸水浴中反应15min，冷却至室温，在490nm测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0056] 将菌株CS07胞外多糖配制成浓度为20mg/mL的溶液，取50μL胞外多糖溶液，补水至500μL，按上述方法测定其吸光值，并根据标准曲线计算其总糖含量。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，建立总糖测定标准曲线。得回归方程为Y＝0.5699x-0.0141，R2＝
0.9944。由图5可知，葡萄糖的浓度与吸光值在0.2mg/mL～1.2mg/mL之间有良好的线性关系。根据线性回归方程，得到上述提取液中胞外多糖糖含量为47％。
[0057] 实施例3Folin-酚法测定荚膜粗多糖蛋白含量
[0058] 分别取500μL浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL的标准牛血清白蛋白溶液，加入试剂甲2.5mL(试剂甲为按50:1混合的NaOH-Na2CO3溶液和酒石酸钾钠-CuSO4溶液，其中NaOH-Na2CO3溶液为0.2mol/LNaOH与4％Na2CO3等体积混合配制成；酒石酸钾钠-CuSO4溶液为2％酒石酸钾钠与1％CuSO4等体积混合配制成)，漩涡振荡后室温放置10min，然后加入试剂乙250μL(试剂乙为稀释一倍的Folin-酚试剂)，再次振荡后并静置1h，在750nm测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0059] 将菌株CS07胞外多糖配制成浓度为1mg/mL的溶液，按上述方法测定其吸光值，并根据标准曲线计算其蛋白含量。以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，建立蛋2
白测定标准曲线(图6)。得回归方程为Y＝0.0034x+0.0186，R＝0.9946。由图6可知，蛋白质的浓度与吸光值在20μg/mL～160μg/mL之间有良好的线性关系。根据线性回归方程，得到胞外多糖经蛋白酶K-Sevag法酶解前后的蛋白含量，分别为41.18％和26.88％，蛋白去除率为
65.27％。
[0060] 实施例4
[0061] 由于蛋白酶K-Sevag法无法将蛋白彻底去除，因此，为排除蛋白杂质对石油凝聚的影响，本实施例测定蛋白杂质对石油的凝聚效果。
[0062] (1)取在LB培养基30℃，150r/min培养7d的菌株CS07发酵液，4℃11000r/min离心30min，收集上清液并记录体积；
[0063] (2)边搅拌边缓慢加入等体积的60％饱和硫酸铵溶液到上清液中；
[0064] (3)将溶液放在磁力搅拌器上搅拌4h，使蛋白质充分沉淀；
[0065] (4)将上述溶液与4℃11000r/min离心30min，弃上清，用无菌水溶解沉淀，制备硫酸铵蛋白沉淀物以测定其对石油的凝聚效果。
[0066] 以60％饱和浓度硫酸铵沉淀物作为分析样品，测定其对石油的凝聚效果。其对石油凝聚的结果如图7所示，A为去离子水对照，水体表面形成油膜；B为硫酸铵沉淀蛋白对石油无凝聚现象，二者均未出现凝聚现象，说明硫酸铵蛋白沉淀物(包括其中的少量多糖)不能使石油凝聚。
[0067] 实施例5胞外多糖对石油的凝聚作用
[0068] 取15mL实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物水溶液，同时设定对照，分别向无菌水、LB培养基以及荚膜粗提物水溶液中加入30μL石油，观察石油的凝聚情况。
[0069] 图8中，A为去离子水对照，形成油膜，无凝聚现象；B为LB培养基对照，形成油膜，无凝聚现象；C为胞外多糖粗提物对石油具有凝聚作用(C1石油加入量为0.1mL，C2石油加入量为0.5mL，C3石油加入量为1.0mL，C4石油加入量为1.5mL)；石油凝聚成球状，且石油加入量从0.1mL增至1.5mL，石油凝聚成球数量也逐渐增加，没有出现随着石油量的增加而成膜的现象。因此，该多糖是引起石油凝聚的主要原因。
[0070] 取实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物EPS1-1、EPS2-1、EPS1-1(6)同时设定去离子水为对照，分别向上述含有胞外多糖粗提物的试管中加入30μL石油混合，观察石油漂浮成膜还是凝聚成球。
[0071] 图9是EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照，石油漂浮水面形成油膜，无凝聚现象；B为EPS1，具有石油凝聚功能，C为EPS2石油成膜，不具有石油凝聚功能。
[0072] 图10是EPS1-1、EPS2-1对石油凝聚情况，其中A为去离子水对照；石油漂浮水面形成油膜，无凝聚现象；B为EPS1-1，具有石油凝聚功能；C为EPS2-1，不具有石油凝聚功能。
[0073] 如图11所示，组分EPS1-1(6)对石油的凝聚效果最好。
[0074] 综上，采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱对菌株CS07胞外多糖进行分离纯化得到两个组分，其中EPS1可使石油凝聚成球状，为主要活性组分。采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步进行分离纯化，EPS1-1(6)具有石油凝聚活性。采用高效液相色谱法检测EPS1-1(6)纯度，结果显示其峰型单一且较对称，无杂峰出现，分离纯度较高，且具有明显的凝聚效果。因此，本发明方法可以获得无杂峰，纯度高的对石油有凝聚效果的胞外多糖。
[0075] 以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
