[0020] 下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
[0021] 实施例1
[0022] 本实施例采用菌株CS07提取胞外多糖，所述的菌株CS07拉丁文学名为Marinobacter maritimus.分类命名：近海海杆菌。所述的菌株CS07采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。所述的菌株CS07已提交保藏，具体保藏信息如下：
[0023] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
[0024] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
[0025] 保藏日期：2016年7月6日；
[0026] 保藏编号：CGMCC No.12739；
[0027] 所述的菌株CS07的形态及理化特征为：菌株CS07在固体LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm[0028] 本实施例具体包括以下步骤：
[0029] (1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL。
[0030] (2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，用封口膜密封三角瓶口，放置于4℃冰箱中，静置过夜。将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液。
[0031] (3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％，封口膜密封瓶口，放置于4℃冰箱，静置24h。醇沉24h后三角瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀。
[0032] (4)向溶液中加入0.1％的蛋白酶K(w/v)，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。
[0033] (5)将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。
[0034] (5.1)DEAE-52纤维素离子交换层析
[0035] ①DEAE-52纤维素的预处理：取DEAE-52纤维素2.5g，加入到40mL 0.5mol/LHCl中，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡30min。加入60mL去离子水，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡10min。倒出上层液体，加入60mL去离子水，搅拌静置后弃上清，重复上述步骤1-2次，然后倾入有100目尼龙滤布的漏斗中。用去离子水充分洗涤，直到流出液pH>4。然后加入40mL 0.5mol/L NaOH浸泡30min后，倾倒上清，用去离子水充分洗涤，直到流出液pH≤3。之后加入100mL 0.01mol/L Na2HPO4浸泡并搅拌，倾去上层液体，重复上述操作，直到溶液pH＝8。
[0036] ②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的DEAE-52纤维素边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后DEAE-52纤维素必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用0.3mol/L NaCl平衡2-3个柱体积即可上样。
[0037] ③上样：加样前，需将柱内DEAE-52纤维素上面多余的液体放出，直到柱内液面与纤维素表面相齐为止。样品上样前需过0.45μm滤膜，上样量为4mL，上样后打开下口开始洗脱。
[0038] ④洗脱：洗脱剂为去离子水、0.3mol/L NaCl、0.6mol/L NaCl、0.9mol/L NaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min，每5mL收集一管，洗脱效果最好。
[0039] ⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分用截留分子量为3500Da的透析袋透析脱盐，第一次隔3h换一次去离子水，之后每隔6h换一次去离子水，重复3～4次。
[0040] 如图1所示，胞外多糖粗提物经过DEAE-52阴离子交换柱层析分离后，由去离子水、0.3mol/L NaCl洗脱分别得到2个组分，命名为EPS1和EPS2。EPS1、EPS2的高效液相色谱图如图2所示。组分EPS1和EPS2未达到对称的单一峰，且EPS2两峰之间未达到较好分离，说明EPS1、EPS2经离子交换层析后并未达到预期的纯度，因此，对这两种胞外多糖还需进行进一步的分离纯化。
[0041] (5.2)凝胶渗透层析
[0042] ①Sephadex G150的预处理：取Sephadex G150凝胶粉8g加入到400mL去离子水中，沸水浴4h，冷却至室温，用去离子水洗涤几次去除杂质，超声脱气。
[0043] ②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的凝胶边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后凝胶必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用NH4HCO3平衡2-3个柱体积即可上样。
[0044] ③上样：加样前，需将柱内凝胶上面多余的液体放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止。取(5.1)分离得到的活性组分过0.45μm滤膜后，上样，上样量为2mL，上样后打开下口开始洗脱。
[0045] ④洗脱：流动相为0.2mol/L NH4HCO3，流速0.2mL/min，每3mL收集一管。
[0046] ⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分旋转蒸发出NH4HCO3并浓缩冻干。如图3所示，EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS1-1。EPS2经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS2-1。
[0047] 组分峰EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析分离后得到组分EPS1-1(6)，采用高效凝胶渗透色谱法对其进行纯度检测，EPS1-1(6)的高效液相色谱图如图4所示，可看出EPS1-1(6)峰型单一且较对称，无杂峰出现，纯度较高。
[0048] 实施例2
[0049] 对实施例1得到胞外多糖进行组分分析，将EPS1-1(6)置于螺旋样品瓶中，加入1ml 2mol/L的三氟乙酸，旋紧瓶口，110℃水解10h。将水解后的样品在60℃真空旋转浓缩后，再以500ul无菌水溶解，备用。采用薄层色谱(TLC)法和高效液相色谱(HPLC)法分析其组分：
[0050] 1、薄层色谱法
[0051] ①点样：取10ul样品点样于10×20CM微晶纤维素板下端约1.5cm处，以5mg/L的果糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖为标准样品，标准样品点样量为2.5ul。
[0052] ②展层：将点样的微晶纤维素板置于展层缸中，以乙酸乙酯：吡啶：冰醋酸：水＝8:5:1:1.5(V/V)为展层剂，上行法展开。
[0053] ③显色：显色剂以1.66g邻苯二甲酸、100ml饱和正丁醇、0.9ml苯胺配制而成，于层析板上方10cm处喷雾，110℃加热5min显色。
[0054] 薄层色谱结果：
[0055] 多糖经三氟乙酸水解后，薄层层析分析结果见图5。由图5计算得出各个样品的Rf值见表1。图5与表1结果表明，待测样品的Rf值与D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D甘露糖比较接近，说明组成多糖的单糖可能含有这3种单糖。
[0056] 表1样品的Rf值
[0057]
[0058]
[0059] 2、高效液相色谱法
[0060] 标准品前处理：将单糖标准品配制成5mg/mL的溶液，过0.22μm水系微孔滤膜，备用。
[0061] 样品前处理：取水解后样品适量，过0.22μm水系微孔滤膜，按设定色谱条件，记录其色谱图，色谱条件如下：
[0062] 色谱柱：Purospher STAR NH2(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1mL/min；流动相：乙腈：水(75：25V/V)；进样量：20μL；漂移管温度：40℃；载气：氮气；柱温：室温；采集时间：40min；
检测器：蒸发光检测器(ELSD)。
[0063] 由图6、7和表2、3结果表明，多糖的单糖可能含有D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D甘露糖这三种单糖，采用高效液相色谱法验证结果表明，初步推测多糖的单糖由L-阿拉伯糖和D-甘露糖组成，摩尔比为1.19:5.33，HPLC色谱图如图6、7所示。
[0064] 表2标准品及样品的HPLC保留时间
[0065]
[0066] 3、单糖组成摩尔比计算：
[0067] 采用公式m＝f×A计算单糖组成摩尔比。
[0068] 其中，m为样品质量，f为效应因子，A为峰面积。
[0069] 由表3及上述公式计算得出，L-阿拉伯糖和D-甘露糖的摩尔比为1.19:5.33。
[0070] 表3标准品及样品的峰面积
[0071]
[0072]
[0073] 实施例3
[0074] 采用高效凝胶渗透色谱法测定EPS1-1(6)的重均分子量，高效凝胶渗透色谱法测定条件如下：
[0075] 色谱柱：Waters UltrahydrogelTM 500(7.8×300mm，5μm)；流速：1mL/min；流动相：屈臣氏蒸馏水；柱温：室温；进样量：70μL；采集时间：60min；检测器：激光检测器(LS)、示差光检测器(RI)。
[0076] 结果显示，EPS1-1(6)的重均分子量(Mw)为26496g/mol。
[0077] 表4 EPS1-1(6)的绝对分子量测定结果
[0078]
[0079] 实施例4
[0080] 胞外多糖对石油的凝聚作用
[0081] 取实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物EPS1-1、EPS2-1、EPS1-1(6)同时设定去离子水为对照，分别向上述含有胞外多糖粗提物的试管中加入30μL石油，观察石油的凝聚情况。
[0082] 图8是EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A去离子水石油成膜，无凝聚现象；B、EPS1使石油凝聚成球；C、EPS2石油成膜，凝聚现象不明显；
[0083] 图9是EPS1-1、EPS2-1对石油凝聚情况，其中A去离子水石油成膜，无凝聚现象；B、EPS1对石油的凝聚效果；C、EPS2对石油无凝聚效果。
[0084] 如图10所示，组分EPS1-1(6)对石油的凝聚效果最好。因此，由L-阿拉伯糖和D-甘露糖两种单糖按照摩尔比为1.19:5.33组成的胞外多糖对石油有凝聚效果的活性组分。
[0085] 以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
