发明内容
[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽，该抗氧化肽活性强，安全无毒副作用，易于消化吸收，可有效清除自由基和抑制脂质过氧化作用。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的制备方法。
[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的应用。
[0007] 本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Leu-Met-Ser-Arg（SEQ No. ID：1），ESI-MS检测给出分子量为651.77 Da（[M+H]+ 652.45 Da）。
[0008] 本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0009] 1）将大黄鱼鱼肉绞碎，按照料液比1 g:8 12 mL加入蒸馏水，调pH值至6. 5 7.5，~ ~于45 55℃保温10 15 min;
~ ~
[0010] 2）按照大黄鱼鱼肉质量的0.8 1.2%加入木瓜蛋白酶，于45 55℃温度下酶解3 5 ~ ~ ~h；将上述酶解液调pH值至9.0 10.0，按照大黄鱼鱼肉质量的1.5 2.0%加入碱性蛋白酶，于~ ~
45 55℃温度下酶解3 5 h；
~ ~
[0011] 3）将酶解液加热到90 95℃灭活10 15 min，5000 6000 r/min离心15 25 min，取~ ~ ~ ~上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化肽。
[0012] 作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
[0013] 超滤：将上清液调至pH 6.5 7.5，用截留分子量3 kDa的超滤膜进行超滤处理，根~据羟基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解物；
[0014] 层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成20 30 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂~分离，用双蒸水、0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下~ ~
的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；
将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成10 20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双~
蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45 55 μg/mL的溶液，利用反~
相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg。
[0015] 优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52 纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15。
[0016] 再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15 20 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18 column ~（4.6 × 250 mm）；柱温为30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0 100 ~
min乙腈浓度从0匀速升至100%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
[0017] 本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的应用，其特征在于Tyr-Leu-Met-Ser-Arg对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有显著的抗氧化活性，可以作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的多肽具有较强的抗氧化活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品或食品添加剂。
