[0021] 通过以下给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。
[0022] 实施例1
[0023] 二色波罗蜜中异戊烯基二苯乙烯 (±)-二色波罗酚A的制备：
[0024] 取二色波罗蜜根13.9 Kg，用95%乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.3 Kg。浸膏以1 L水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取 (体积比2:1)，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏118.9 g，HP-20大孔吸附树脂拌样(重量比 1:1)，上HP-20型大孔吸附树脂柱 (柱规格：10*45 cm)，以乙醇-水 (0 95%) 梯度洗脱，得到6个流分Frs. H1-~H6。50%乙醇洗脱流份Fr. H4 (44.8 g) 经过ODS柱色谱 (柱规格：4*22 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到15个流分Frs. H4O1-H4O15。流分Fr. H4O3 (4.6 g) 经MCI CHP-20P 树脂柱色谱 (柱规格：4*45 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4,
7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到5个流分Frs. H4O3M1-H4O3M5。流分Fr. H4O3M3 (1.8 g) 进一步经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱 (柱规格：2*200 cm)，甲醇洗脱得6个流分Frs. H4O3M3L1-H4O3M3L6。流分H4O3M3L2 (0.3 g) 经过制备HPLC柱色谱 (柱规格：2*25 cm)，50%乙腈洗脱，获得了本发明所述的化合物 (±)-二色波罗酚A (40.3 mg, tR 45 min)。
[0025] 实施例2
[0026] 二色波罗蜜中异戊烯基二苯乙烯 (±)-二色波罗酚A的结构鉴定：
[0027] (±)-二色波罗酚A，一种黄色无定型粉末 (丙酮)。HR-ESI-MS 给出准分子离子峰m/z 379.1906 ([M-H]-，计算值: 379.1915)，确定其分子式为C24H28O4。其紫外光谱显示了非共轭芳环的特征吸收 (λmax 211和285 nm)，提示(±)-二色波罗酚A可能为一个二氢二苯乙烯衍生物。(±)-二色波罗酚A的1H NMR谱 (600 MHz, acetone-d6) 显示了以下质子信号：一对间位耦合的芳环质子δH 6.23 (1 H, d, J = 2.3 Hz, H-2) 和 6.07 (1 H, d, J = 2.3 Hz, H-4); 两个以单峰形式出现的芳环质子δH 6.98 (1 H, s, H-7) 和6.37 (1 H, s, H-10); 一个1,1-二甲基烯丙基型异戊二烯取代基δH 6.24 (1 H, dd, J = 17.5, 10.6 Hz, H-23), 4.97 (1 H, dd, J = 17.5, 1.6 Hz, Hα-24), 4.93 (1 H, dd, J =
10.6, 1.6 Hz, Hβ-24) 和1.42 (6 H, s, H3-21,22) (表1)。其它11个质子信号可识别为：
一个端烯δH 4.75 (1 H, d, J = 2.3 Hz, Ha-18) 和4.56 (1 H, m, Hb-18)；两个亚甲基δH 2.77 (1 H, dd, J = 16.5, 5.5 Hz, Hα-5), 2.74 (1 H, dd, J = 16.5, 11.8 Hz, Hβ-5), 2.84 (1 H, dd, J = 16.2, 5.3 Hz, Hα-14)和2.56 (1 H, dd, J = 16.2, 11.8 Hz, Hβ-14)；两个次甲基δH 3.28 (1 H, td, J = 11.8, 5.5 Hz, H-6) 和2.87 (1 H, td, J = 11.8, 5.3 Hz, H-13)；一个单峰甲基δH 1.58 (3 H, s, H3-19) (表1)。分析(±)-二
1 1
色波罗酚A的 H-H COSY、HSQC和 HMBC谱，可以将这11个质子拼接两个相互连接的结构片段–CH2–CH–CH–CH2– 和 –CH–C(Me)=CH2。以下对HSQC和HMBC数据的进一步分析，使我们确定了(±)-二色波罗酚A的化学结构。H3-21/22 (δH1.42) 和H-23 (δH6.24)与C-8 (δC125.4)具有HMBC远程相关 (图9)，这表明1.1-二甲基烯丙基连接在C-8上。一些关键的HMBC相关峰确认了这样的结构片段，即，(±)-二色波罗酚A中C环的一端通过C-15/C-16与A环稠合，另一端连接到B环的C-17：H-5 (δH2.77)与C-4 (δC106.8)、C-15 (δC115.1)、C-16 (δC139.6)和C-17 (δC122.1)相关；H-6 (δH3.28) 与C-5 (δC39.4)、C-7 (δC127.8)、C-11 (δC154.2)、C-13 (δC47.8) 和C-17具有相关；H-13 (δH2.87)与C-15和C-17相关；Hα/Hβ-14 (δH2.84/
2.56) 和C-1 (δC156.4)、C-6 (δC37.1) 和C-16相关 (图9)。而片段-CH-C(Me)=CH2连接在C环的C-13上，也可通过以下HMBC相关确认：Ha/Hb-18 (δH4.75/4.56)与C-12 (δC149.6)，C-
13和C-19 (δC18.8) 相关；H-13与C-12，C-18 (δC111.6) 和C-19相关 (图9)。以上数据，确认了(±)-二色波罗酚A的平面结构。通过H-6和H-13之间的耦合常数J6.13 = 11.8 Hz，可以判断C-6和C-13之间的相对构型为反式，这可以通过NOESY谱中H-6与Ha/Hb-18和H3-19的NOE相关得到进一步证实。在这些数据的基础上，我们全归属了(±)-二色波罗酚A的一维NMR谱中的氢、碳信号 (表1)。经测试，(±)-二色波罗酚A的旋光度为0，其圆二色谱也显示其没有科顿效应 (Cotton effect)，这提示(±)-二色波罗酚A为一个外消旋体。我们进一步用手性柱 [Phenomenex Lux Cellulose-2 column (5 μM, i.d. 250 × 4.6 mm)] 对(±)-二色波罗酚A进行了HPLC分析，结果表明，在乙腈-水为流动相 (3:1, v/v)，流速1.2 mL/min的条件下，(±)-二色波罗酚A显示了峰面积比为1:1的两个色谱峰。这进一步证实了(±)-二色波罗酚A为一个由等量对映异构体组成的外消旋体。因此，我们最终确定 (±)-二色波罗酚A的结构为 [6S(R),7S(R)]-6-[2,4-二羟-5-(1,1-二甲基烯丙基)苯基]-7-(丙-1-烯-
2-基)-5,6,7,8-四氢萘-1,3-二醇，其结构式如图1所示。
[0028] 表1 (±)-二色波罗酚A的核磁共振氢谱和碳谱数据
[0029]
[0030] 实施例3
[0031] (±)-二色波罗酚A对大鼠PMNs的细胞毒性评价实验：
[0032] 采用以下实验步骤分离、纯化大鼠PMNs。取清洁级SD大鼠 (江西中医药大学实验动物中心，动物合格证号：JZDW2011304)，眼眶取血9 mL，垂直滴入用1 mL 1％肝素钠抗凝好的玻璃离心管中。以5:1的比例加入4.5%的葡聚糖T-500生理盐水溶液混匀，4°C 静置约1 小时。取上清液，按3:1的比例加到预先装有淋巴细胞分离液的离心管内，800转/分钟 (275 g) 离心15分钟，取出离心管，管内分三层，上层是淡黄色血清，中部白色雾状区为单核细胞和淋巴细胞，下层沉降到管底的是PMNs。弃上清液，加入2 mL特殊分离液漂洗一次，振荡后于2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟。弃上清液，往每个离心管内加2 mL双蒸水，吹打、振荡20秒 (将红细胞溶胀) 后，立即加入1.8%的NaCl溶液2 mL混匀，2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟，弃上清，重复此操作，直至无血细胞残留。再以HBSS-FCS缓冲液漂洗1-2次，每次用HBSS-FCS溶液2 mL,均在2500转/分钟 (531 g) 离心3分钟，弃去上清液。分离得PMNs，再次加入HBSS-FCS缓冲液2 mL，混匀，台盼蓝染色法测活力 (3 h内PMNs的活力>95%)，4°C保存作为细胞母悬液备用。
[0033] 参照标准台盼蓝排除法的相关文献测定 (±)-二色波罗酚A对PMNs的细胞毒性。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。取1 mL的PMNs细胞稀释液与10 μL DMSO或 (±)-二色波罗酚A (用DMSO溶解，终浓度范围从1到
1000 μM) 混合，37°C下孵育30分钟。每份样本中加入112 μL 0.4%的台盼蓝染液，高倍显微镜下，通过计数100个细胞吸收台盼蓝的情况来计算样品对PMNs的细胞毒性作用。结果表明，(±)-二色波罗酚A在150 μM以上才开始表现对PMNs的毒性。
[0034] 实施例4 (±)-二色波罗酚A对大鼠PMNs呼吸爆发抑制率的测定：
[0035] 采用与实施例3相同的步骤制备大鼠PMNs细胞母悬液。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。4°C保存备用。PMNs在受到外源性刺激剂-佛波豆蔻酸乙酯 (佛波醇) (PMA) 激活后发生呼吸爆发，产生大量的活性氧自由基，自由基被发光剂鲁米诺捕获产生化学发光 (Chemiluminesence，CL)，PMN-CL强度与PMNs的细胞数量及PMNs的呼吸爆发和吞噬功能正相关。BPCL-K超微弱发光测量仪(中国科学院北京生物物理研究所，配套BPCL Appl.7.2数据处理工作站) 参数设定为：发光池温度37°C，电压值800 V，最长检测时间1800 s，计数时间间隔5 s。使用前将仪器预热半小时，并走基线。待基线平稳后，取1 ml PMNs细胞稀释液于发光杯中，向其中加入200 μl鲁米诺工作液，置于超微弱发光测量仪中孵育10 min (参数设定：发光池温度37°C，电压800 V，最长检测时间1800 s)，记录自发光过程 (计数时间间隔5 s)。然后加入10 μl 样品溶液 (以10 μl DMSO为溶剂对照) 继续测定5 min，加入8 μg·ml-1 PMA刺激剂10 μl，继续测定15 min, 记录测定结果。PMN-CL强度以发光记数峰高表示。按公式(1)计算PMN-CL抑制率。
[0036] (1)
[0037] 以PMN-CL抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，建立量效关系曲线，通过量效曲线可求算出发光抑制率为50%时样品的浓度 (即IC50值)。以维生素C (Vc) 作为阳性对照。结果表明，(±)-二色波罗酚A对PMA刺激的大鼠PMNs爆发具有显著的抑制作用，其IC50为2.62±0.35 μM，优于阳性对照Vc (IC50 = 24.51±1.64 μM)。
