[0020] 通过以下给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。
[0021] 实施例1 二色波罗蜜中二苯乙烯衍生物(±)-二色波罗酚C的制备
[0022] 取二色波罗蜜根13.9 Kg，用95%乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.3 Kg。浸膏以1 L水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取 (体积比2:1)，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏118.9 g，HP-20大孔吸附树脂拌样(重量比 1:1)，上HP-20型大孔吸附树脂柱 (柱规格：10*45 cm)，以乙醇-水 (0 95%) 梯度洗脱，得到6个流分Frs. H1-~H6。50%乙醇洗脱流份Fr. H4 (44.8 g) 经过ODS柱色谱 (柱规格：4*22 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到15个流分Frs. H4O1-H4O15。流分Fr. H4O3 (4.6 g) 经MCI CHP-20P 树脂柱色谱 (柱规格：4*45 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4,
7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到5个流分Frs. H4O3M1-H4O3M5。流分Fr. H4O3M3 (1.8 g) 进一步经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱 (柱规格：2*200 cm)，甲醇洗脱得6个流分Frs. H4O3M3L1-H4O3M3L6。流分H4O3M3L1 (0.2 g) 经过制备HPLC柱色谱 (柱规格：2*25 cm)，50%乙腈洗脱，获得了本发明所述的化合物 (±)-二色波罗酚C (3.0 mg, tR 40 min)。
[0023] 实施例2 二色波罗蜜中二苯乙烯衍生物 (±)-二色波罗酚C的结构鉴定[0024] (±)-二色波罗酚C，一种黄色无定型粉末 (甲醇)。HR-ESI-MS 给出准分子离子峰m/z 379.1907 ([M-H]-，计算值: 379.1915)，确定其分子式为C24H28O4。(±)-二色波罗酚C的1H NMR谱 (600 MHz, methanol-d4) 显示了以下质子信号：一套芳香ABX自旋耦合体系质子δH 7.16 (1 H, d, J = 8.5 Hz, H-7), 6.31 (1 H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz, H-8) 和6.16 (1 H, d, J = 2.5 Hz, H-10); 一对间位耦合的芳香质子δH 6.24 (1 H, d, J =
2.3 Hz, H-4) 和6.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz, H-2); 一套1,1-二甲基烯丙基型异戊二烯取代基质子δH 5.84 (1 H, dd, J = 17.9, 10.4 Hz, H-23), 4.95 (1 H, dd, J = 17.9,
1.3 Hz, Hα-24), 4.94 (1 H, dd, J = 10.4, 1.3 Hz, Hβ-24), 1.14 (3H, s, H3-21)和
0.99 (3H, s, H3-22)。此外，经分析 (±)-二色波罗酚C的1H-1H COSY、HSQC和 HMBC谱，可以将以下11个质子拼接成两个相互连接的结构片段-CH-CH-CH-CH2-和-CH-C(Me2)O-：δH
3.19 (1 H, d, J = 4.0 Hz, Hα-5), 2.85 (1 H, dd, J = 12.0, 4.0 Hz, H-6), 1.20 (1 H, td, J = 12.0, 2.8 Hz, H-13), 2.91 (1 H, dd, J = 14.3, 2.8 Hz, Hα-14),
2.01 (1 H, t, J = 13.1 Hz, Hβ-14), 1.40 (3 H, s, H3-18)和1.31 (3 H, s, H3-19)
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(表1)。(±)-二色波罗酚C的H NMR谱与已知化合物hypargystilbene B非常相似，主要的区别是 (±)-二色波罗酚C在低场区多了一个芳环质子信号δH 6.31，而高场区原来在hypargystilbene B中归属于H-5的信号δH 2.47在(±)-二色波罗酚C的氢谱中消失了。这强烈提示1,1-二甲基烯丙基取代发生在C-5而不是C-8。这个推测获得了HMBC数据的支持：H3-
21 (δH 1.14)和H3-22 (δH 0.99) 与C-5 (δC 51.6) 存在HMBC相关；H-23 (δH 5.84) 与C-5有HMBC相关 (图8)。另外，通过分析HMBC数据，我们进一步确定了A环和B环的氧化取代类型。H-6与H-13之间的耦合常数J6.13 为 12.0 Hz，这表明C-6和C-13具有反式相对构型。在此基础上，我们全归属了(±)-二色波罗酚C的一维NMR谱中的氢、碳信号(表1)。经测试，(±)-二色波罗酚C的旋光度为0，其圆二色谱也显示其没有科顿效应 (Cotton effect)，这提示(±)-二色波罗酚C为一个外消旋体。我们进一步用手性柱 [Phenomenex Lux Cellulose-2 column (5 μM, i.d. 250 × 4.6 mm)] 对(±)-二色波罗酚C进行了HPLC分析，结果表明，在乙腈-水为流动相 (3:1, v/v)，流速1.2 mL/min的条件下，(±)-二色波罗酚C显示了峰面积比为1:1的两个色谱峰。这进一步证实了(±)-二色波罗酚C为一个由等量对映异构体组成的外消旋体。因此，我们最终确定 (±)-二色波罗酚C的化学结构为 [6aS(R),12R(S),
12aS(R)]-6,6-二甲基-12-(1,1-二甲基烯丙基)-6a,7,12,12a-四氢-6H-萘并[2,3-c]色原烯-3,8,10-三醇。其结构式如图1所示。
[0025] 表1 (±)-二色波罗酚C 的核磁共振氢谱和碳谱数据
[0026]
[0027] 实施例3 (±)-二色波罗酚C对大鼠PMNs的细胞毒性评价实验
[0028] 采用以下实验步骤分离、纯化大鼠PMNs。取清洁级SD大鼠 (江西中医药大学实验动物中心，动物合格证号：JZDW2011304)，眼眶取血9 mL，垂直滴入用1 mL 1％肝素钠抗凝好的玻璃离心管中。以5:1的比例加入4.5%的葡聚糖T-500生理盐水溶液混匀，4°C 静置约1 小时。取上清液，按3:1的比例加到预先装有淋巴细胞分离液的离心管内，800转/分钟 (275 g) 离心15分钟，取出离心管，管内分三层，上层是淡黄色血清，中部白色雾状区为单核细胞和淋巴细胞，下层沉降到管底的是PMNs。弃上清液，加入2 mL特殊分离液漂洗一次，振荡后于2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟。弃上清液，往每个离心管内加2 mL双蒸水，吹打、振荡20秒 (将红细胞溶胀) 后，立即加入1.8%的NaCl溶液2 mL混匀，2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟，弃上清，重复此操作，直至无血细胞残留。再以HBSS-FCS缓冲液漂洗1-2次，每次用HBSS-FCS溶液2 mL,均在2500转/分钟 (531 g) 离心3分钟，弃去上清液。分离得PMNs，再次加入HBSS-FCS缓冲液2 mL，混匀，台盼蓝染色法测活力 (3 h内PMNs的活力>95%)，4°C保存作为细胞母悬液备用。
[0029] 参照标准台盼蓝排除法的相关文献测定(±)-二色波罗酚C对PMNs的细胞毒性。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。取1 mL的PMNs细胞稀释液与10 μL DMSO或 (±)-二色波罗酚C (用DMSO溶解，终浓度范围从1到
1000 μM) 混合，37°C下孵育30分钟。每份样本中加入112 μL 0.4%的台盼蓝染液，高倍显微镜下，通过计数100个细胞吸收台盼蓝的情况来计算样品对PMNs的细胞毒性作用。结果表明，(±)-二色波罗酚C在150 uM以上才开始表现对PMNs的毒性。
[0030] 实施例4 (±)-二色波罗酚C对大鼠PMNs呼吸爆发抑制率的测定
[0031] 采用与实施例3相同的步骤制备大鼠PMNs细胞母悬液。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。4°C保存备用。PMNs在受到外源性刺激剂-佛波豆蔻酸乙酯 (佛波醇) (PMA) 激活后发生呼吸爆发，产生大量的活性氧自由基，自由基被发光剂鲁米诺捕获产生化学发光 (Chemiluminesence，CL)，PMN-CL强度与PMNs的细胞数量及PMNs的呼吸爆发和吞噬功能正相关。BPCL-K超微弱发光测量仪(中国科学院北京生物物理研究所，配套BPCL Appl.7.2数据处理工作站) 参数设定为：发光池温度37°C，电压值800 V，最长检测时间1800 s，计数时间间隔5 s。使用前将仪器预热半小时，并走基线。待基线平稳后，取1 ml PMNs细胞稀释液于发光杯中，向其中加入200 μl鲁米诺工作液，置于超微弱发光测量仪中孵育10 min (参数设定：发光池温度37°C，电压800 V，最长检测时间1800 s)，记录自发光过程 (计数时间间隔5 s)。然后加入10 μl 样品溶液 (以10 μl DMSO为空白对照) 继续测定5 min，加入8ug·ml-1 PMA刺激剂10 μl，继续测定15 min, 记录测定结果。PMN-CL强度以发光记数峰高表示。按公式(1)计算PMN-CL抑制率。
[0032] PMN-CL抑制率 (%) = ×100% (1)
[0033] 以PMN-CL抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，建立量效关系曲线，通过量效曲线可求算出发光抑制率为50%时样品的浓度 (即IC50值)。以维生素C (Vc) 作为阳性对照。结果表明，(±)-二色波罗酚C对PMA刺激的大鼠PMNs爆发具有显著的抑制作用，其IC50为4.24±0.58 uM，优于阳性对照Vc (IC50 = 24.51±1.64 uM)。
