二色波罗蜜中的二苯乙烯类化合物及其在制备治疗炎症性疾病药物中的用途   0    0

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及二色波罗蜜中的一种二苯乙烯类化合物在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

[0002] PMNs作为宿主防御外来病原体入侵的第一道防线，当外来病原菌入侵时被激活，然后主要通过呼吸爆发 (释放氧自由基) 和脱颗粒 (释放多种蛋白水解酶) 而发挥杀菌功能。但PMNs 的激活是一把双刃剑，正常时能消灭外源性病原体、清除坏死组织、促进伤口愈合，是机体的“保护者”。但在某些病理条件下 (如严重创伤、烧伤、休克、缺血再灌注等)，PMNs 过度激活却可阻塞微循环、损伤血管内皮细胞和血管外组织细胞、释放和促进释放炎症介质，成为“破坏者”，是导致全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭的重要原因。目前渥曼青霉素(wortmannin)、一些大环内酯类抗生素及非甾体抗炎药等抗生素类药物在临床上被用于一般性炎症疾病的治疗。然而，因PMNs 呼吸爆发所引起的失控性炎性反应与细菌等病原体感染无关，经常导致抗生素治疗无效。因此，发现抑制PMNs呼吸爆发的药物用于控制PMNs呼吸爆发所致的严重炎症反应具有重要意义。

[0003] 从天然药物中分离鉴定结构新颖、活性显著的天然产物一直是新药发现的主要途径之一。二色波罗蜜(Artocarpus styracifolius Pierre)为桑科波罗蜜属的一种乔木树种。据记载，二色波罗蜜在民间有多重药用用途，比如治疗银屑病、糖尿病和偏瘫等。现代化学和药理研究表明，二色波罗蜜的根富含大量的异戊烯基酚性成分，这些成分具有广泛的药理活性。本课题组在前期的活性筛选中发现，二色波罗蜜根95%乙醇提取物的氯仿萃取部位对大鼠PMNs呼吸爆发表现了较强的抑制活性。因此，本发明对该活性部位进行了深入的研究。

[0004] 本发明的目的是提供具有抑制PMNs呼吸爆发活性的物质，为临床上与PMNs呼吸爆发相关炎症的治疗提供药物。具体涉及二色波罗蜜根中提取的一种二苯乙烯衍生物，具有如下所示的化学结构：

[0005] 。

[0006] 该化合物是未见文献报道的新化合物，为一个外消旋体，命名为(±)-二色波罗酚E。

[0007] 本发明的进一步目的是提供上述化合物在制备抗炎 (与PMNs呼吸爆发相关炎症) 药物中的新用途。

[0008] 本发明所述化合物通过下述方法制备：

[0009] 取二色波罗蜜根13.9 Kg，用95%乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.3 Kg。所得浸膏以水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏118.9 g，上HP-20型大孔吸附树脂柱，用乙醇-水梯度洗脱。乙醇-水 (3:7) 洗脱所得流份，分别经过MCI CHP-20P树脂柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及制备液相色谱得到化合物反式氧化白藜芦醇。乙醇-水 (1:1) 洗脱所得流份，分别经过ODS柱色谱、MCI CHP-20P树脂柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及制备液相色谱得到本发明所述的化合物 (±)-二色波罗酚E。

[0010] 经过活性筛选实验证实，本发明所述的  (±)-二色波罗酚E对佛波豆蔻酸乙酯 (PMA) 刺激的大鼠中性粒细胞爆发具有显著的抑制作用，半数抑制浓度 (IC50) 为0.45±0.13 uM，活性优于阳性对照Vc (IC50 = 24.51±1.64 uM)。

[0011] 本发明所述的二苯乙烯类化合物 (±)-二色波罗酚E可进一步制备成治疗PMNs呼吸爆发失控所致炎症的药物。

[0020] 通过以下给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。

[0021] 实施例1 二色波罗蜜中二苯乙烯类化合物(±)-二色波罗酚E的制备

[0022] 取二色波罗蜜根13.9 Kg，用95%乙醇渗漏提取，提取液减压浓缩得浸膏1.3 Kg。浸膏以1 L水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取 (体积比2:1)，并分别浓缩至干。取氯仿萃取部位浸膏118.9 g，HP-20大孔吸附树脂拌样(重量比 1:1)，上HP-20型大孔吸附树脂柱 (柱规格：10*45 cm)，以乙醇-水 (0 95%) 梯度洗脱，得到6个流分Frs. H1-~H6。

[0023] 50%乙醇洗脱流份Fr. H4 (44.8 g) 经过ODS柱色谱 (柱规格：4*22 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到15个流分Frs. H4O1-H4O15。流分Fr. H4O3 (4.6 g) 经MCI CHP-20P 树脂柱色谱 (柱规格：4*45 cm)，MeOH-H2O (体积比6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0) 梯度洗脱，得到5个流分Frs. H4O3M1-H4O3M5。流分Fr. H4O3M3 (1.8 g) 进一步经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱 (柱规格：2*200 cm)，甲醇洗脱得6个流分Frs. H4O3M3L1-H4O3M3L6。从流分Fr. H4O3M3L4 (0.5 g) 经过制备HPLC柱色谱 (柱规格：2*25 cm)，60%乙腈洗脱，获得了本发明所述的化合物 (±)-二色波罗酚E (7.2 mg, tR 24 min)。

[0024] 实施例2 二色波罗蜜中二苯乙烯类化合物 (±)-二色波罗酚E的结构鉴定[0025] (±)-二色波罗酚E为一种黄色无定型粉末。HR-ESI-MS 给出准分子离子峰m/z 395.1855 ([M+H]+，计算值: 395.1853)，确定其分子式为C24H26O5。(±)-二色波罗酚E的1H NMR谱 (600 MHz, methanol-d4) 与已知的双异戊烯基取代二苯乙烯hypargystilbene D高度相似。与hypargystilbene D相比，(±)-二色波罗酚E少了hypargystilbene D中归属于饱和质子H-5的信号δH 5.14。进一步比较 (±)-二色波罗酚E和hypargystilbene D的13C NMR谱 (150 MHz, methanol-d4)可见，(±)-二色波罗酚E缺少了hypargystilbene D中sp3杂化的含氧次甲基碳信号C-5（δC 69.5），此信号被羰基碳信号δC 200.0取代。这强烈提示，(±)-二色波罗酚E是由hypargystilbene D在C-5上进一步氧化得到的羰基化衍生物。通过分析HSQC和HMBC谱，我们全归属了(±)-二色波罗酚E的一维NMR谱中的氢、碳信号(表1)，并确定了两个异戊烯基的取代位置及A环、B环的氧化取代类型。H-6与H-13之间的耦合常数J6.13 为 4.8 Hz，这表明C-6和C-13具有顺式相对构型。经测试，(±)-二色波罗酚E的旋光度为0，其圆二色谱也显示其没有科顿效应 (Cotton effect)，这提示 (±)-二色波罗酚E为一个外消旋体。我们进一步用手性柱 [Phenomenex Lux Cellulose-2 column (5 μM, i.d. 250 × 4.6 mm)] 对 (±)-二色波罗酚E进行了HPLC分析，结果表明，在乙腈-水为流动相 (3:1, v/v)，流速1.2 mL/min的条件下，(±)-二色波罗酚E显示了峰面积比为1:1的两个色谱峰。这进一步证实了 (±)-二色波罗酚E为一个由等量对映异构体组成的外消旋体。因此，我们最终确定了(±)-二色波罗酚E的化学结构为 [6aS(R),12aR(S)]-8,10-二羟基-6,6-二甲基-2-(1,1-二甲基烯丙基)-6a,7-二氢-6H-萘并[2,3-c]色原烯-12(12aH)-酮，其结构式如图1所示。

[0026] 表1 (±)-二色波罗酚E的核磁共振氢谱和碳谱数据

[0027]

[0028] 实施例3 二色波罗蜜中 (±)-二色波罗酚E对大鼠PMNs的细胞毒性评价实验[0029] 采用以下实验步骤分离、纯化大鼠PMNs。取清洁级SD大鼠 (江西中医药大学实验动物中心，动物合格证号：JZDW2011304)，眼眶取血9 mL，垂直滴入用1 mL 1％肝素钠抗凝好的玻璃离心管中。以5:1的比例加入4.5%的葡聚糖T-500生理盐水溶液混匀，4°C 静置约1 小时。取上清液，按3:1的比例加到预先装有淋巴细胞分离液的离心管内，800转/分钟 (275 g) 离心15分钟，取出离心管，管内分三层，上层是淡黄色血清，中部白色雾状区为单核细胞和淋巴细胞，下层沉降到管底的是PMNs。弃上清液，加入2 mL特殊分离液漂洗一次，振荡后于2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟。弃上清液，往每个离心管内加2 mL双蒸水，吹打、振荡20秒 (将红细胞溶胀) 后，立即加入1.8%的NaCl溶液2 mL混匀，2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟，弃上清，重复此操作，直至无血细胞残留。再以HBSS-FCS缓冲液漂洗1-2次，每次用HBSS-FCS溶液2 mL,均在2500转/分钟 (531 g) 离心3分钟，弃去上清液。分离得PMNs，再次加入HBSS-FCS缓冲液2 mL，混匀，台盼蓝染色法测活力 (3 h内PMNs的活力>95%)，4°C保存作为细胞母悬液备用。

[0030] 采用台盼蓝排除法，测定 (±)-二色波罗酚E对PMNs的细胞毒性。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。取1 mL的PMNs细胞稀释液与10 μL DMSO或待测化合物 (用DMSO溶解，终浓度范围从1到1000 μM) 混合，37°C下孵育30分钟。每份样本中加入112 μL 0.4%的台盼蓝染液，高倍显微镜下，通过计数100个细胞吸收台盼蓝的情况来计算样品对PMNs的细胞毒性作用。结果表明，(±)-二色波罗酚E在150 uM以上才开始表现对PMNs的毒性。

[0031] 实施例4 二色波罗蜜中 (±)-二色波罗酚E对大鼠PMNs呼吸爆发抑制率的测定[0032] 采用与实施例3相同的步骤制备大鼠PMNs细胞母悬液。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×106 个/mL。4°C保存备用。PMNs在受到外源性刺激剂-佛波豆蔻酸乙酯 (佛波醇) (PMA) 激活后发生呼吸爆发，产生大量的活性氧自由基，自由基被发光剂鲁米诺捕获产生化学发光 (Chemiluminesence，CL)，PMN-CL强度与PMNs的细胞数量及PMNs的呼吸爆发和吞噬功能正相关。BPCL-K超微弱发光测量仪(中国科学院北京生物物理研究所，配套BPCL Appl.7.2数据处理工作站) 参数设定为：发光池温度37°C，电压值800 V，最长检测时间1800 s，计数时间间隔5 s。使用前将仪器预热半小时，并走基线。待基线平稳后，取1 ml PMNs细胞稀释液于发光杯中，向其中加入200 μl鲁米诺工作液，置于超微弱发光测量仪中孵育10 min (参数设定：发光池温度37°C，电压800 V，最长检测时间1800 s)，记录自发光过程 (计数时间间隔5 s)。然后加入10 μl 样品溶液 (以10 μl DMSO为空白对照) 继续测定5 min，加入8 ug·ml-1 PMA刺激剂10 μl，继续测定15 min, 记录测定结果。PMN-CL强度以发光记数峰高表示。按公式(1)计算PMN-CL抑制率。

[0033] PMN-CL抑制率 (%) =  ×100%                 (1)

[0034] 以PMN-CL抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，建立量效关系曲线，通过量效曲线可求算出发光抑制率为50%时样品的浓度 (即IC50值)。以维生素C (Vc) 作为阳性对照。结果表明，(±)-二色波罗酚E对PMA刺激的大鼠PMNs爆发具有显著的抑制作用，其IC50为 0.45±0.13 uM，均优于阳性对照Vc (IC50 = 24.51±1.64 uM)。

[0012] 图1为本发明所述新化合物 (±)-二色波罗酚E的化学结构式。

[0013] 图2为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振氢谱(1H NMR)。

[0014] 图3为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振碳谱(13C NMR)。

[0015] 图4为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振DEPT 135谱。

[0016] 图5为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振1H-1H COSY谱。

[0017] 图6为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振HSQC谱。

[0018] 图7为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的核磁共振HMBC谱。

[0019] 图8为本发明所述新化合物(±)-二色波罗酚E的主要HMBC (H→C)和COSY相关。