实施方案
[0022] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0023] 一种蟹壳下脚料抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：蟹壳下脚料-脱脂-酶解-酶解物-超滤-大孔树脂纯化-阴离子交换层析-凝胶过滤层析-反相高效液相色谱制备-抗氧化肽。
[0024] 具体步骤为：
[0025] 1）蟹壳下脚料预处理：取过100目筛的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）蟹壳下脚料，按照料液比1g: 8mL加入异丙醇，于45℃脱脂8 h，然后于9000 rpm离心10 min除去异丙醇，收集脱脂蟹壳下脚料固形物。
[0026] ）蟹壳下脚料的酶解：将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10mL加入磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.0），混合液温度升至45℃、超声处理15 min；然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.2%加入中性蛋白酶，在45℃酶解5 h；将酶解液升温至90℃后恒温保持15 min，酶解液温度降至55℃，按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.2%加入木瓜蛋白酶，在55℃酶解4 h，冷却至室温，于10000 rpm离心10min，除去沉淀物，得到酶解液。
[0027] ）蟹壳下脚料抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍DA201-C大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到蟹壳下脚料抗氧化肽。
[0028] ①阴离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为50 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂（DEAE Sepharose FF）层析柱分离，用水、0.30 mol/L、和0.50 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物Fr.5（图1）。
[0029] ②凝胶色谱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物Fr.5-III（图2）。
[0030] ③高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80 100 μg/mL的溶~液，利用RP-HPLC进行纯化(条件为：进样量8 10 μL；色谱柱Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 ~
mm，5 μm）；流动相：25%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.5 0.8 mL/min；紫外检测波长~
215 nm)，根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽（图3）。
[0031] ④结构检测：收集羟基自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp + (IWMECNW)，ESI-MS测定分子量为979.15 Da（[M+H] 980.11 Da）（图4）。
[0032] 将制得的蟹壳下脚料抗氧化肽Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp (IWMECNW)进行自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验，实验结果表明：Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp (IWMECNW)对DPPH 自由基（EC50 1.561 mg/mL）、羟基自由基（EC50 0.145 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50 0.102 mg/mL）具有良好的清除作用；同时，Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp (IWMECNW)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用，可用于药品、食品、保健食品作为添加剂使用。
[0033] 序列表
[0034] SEQUENCE LISTING
[0035] <110>浙江海洋学院
[0036] <120>脱脂蟹壳抗氧化肽的用途
[0037] <130>zjou-wb07-03
[0038] <160>1
[0039] <170>PatentIn version 3.5
[0040] <210>1
[0041] <211>7
[0042] <212>PRT
[0043] <213>人工合成
[0044] <400>1
[0045] Ile Trp Met Glu Cys Asn Trp
[0046] 1 5
