实施方案
[0020] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0021] 实施例:
[0022] 双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法,制备工艺流程如下:双髻鲨鱼肉→双酶酶解→酶解物→超滤→大孔树脂纯化→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→抗氧化肽。
[0023] )双髻鲨鱼肉的预处理:取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆,加热至95 ℃后保温8min,然后按照料液比1g:3 mL加入异丙醇,于25℃、功率500 W超声提取3 h,然后于4℃、10000 rpm离心10 min除去异丙醇,收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物;
[0024] 2)脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解:取脱脂双髻鲨鱼肉固形物,按固液比1 g:12 mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L,pH 9.5),用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH到9.5,得混合液;将混合物温度调制60℃,按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%加入碱性蛋白酶(酶活力≥1.95×105 U/g),酶解时间2.5 h后,酶解液于95℃保温15min,灭酶活;将酶解液温度调至40℃,按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力≥2.5×104 U/g),酶解时间34 h,酶解液于95℃保温15min后降至室温,于12000 rpm离心10 min,取上清液。
[0025] )双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备:将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化,得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。
[0026] ①超滤:将上述酶解上清液采用采用1 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于1 kDa部分,得超滤酶解液。
[0027] ②大孔树脂精制:将超滤酶解液配成20 mg/mL的溶液,缓慢加入到滤酶解液与D101大孔树脂重量体积比(mg/mL)为1:15的玻璃柱中,用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质,再用4倍柱体积的95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱物,喷雾干燥,即为大孔树脂精制多肽。
[0028] ③凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为25 mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,流速为1.0 mL/min,洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测,按峰合并试管内溶液,比较各峰的羟基自由基的清除活性,选择活性最强组分冻干,即为凝胶层析酶解物Fr.3(图1);
[0029] ④RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成95 μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化(再优选,所述RP-HPLC条件为:进样量20 μL;色谱柱Zorbax SB- C1(8 250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:水-乙腈梯度洗脱(0~45min乙腈浓度由0匀速升至45%);洗脱速度0.8 mL/min;紫外检测波长220 nm),根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽(图2)。
[0030] ⑤结构检测:收集羟自由基清除活性最高的多肽DCPE-B,经RP-HPLC检测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP),ESI-MS测定分子量为610.77 Da。
[0031] 自由基清除实验:将制得的双髻鲨鱼肉抗氧化肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)进行自由基清除实验。实验结果表明:Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)对DPPH 自由基(EC50 1.89 mg/mL)、羟基自由基(EC50 0.28 mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC50 0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0032] 抗氧化肽对激活Nrf2/ARE 通路的作用:取对数生长期的人胚肾细胞株HEK293 细胞接种于60mm 皿24 小时后,分别加入10μM的酶解液和Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP),继续培养4 小时。弃去上清,细胞用RIPA 缓冲液( 上海碧云天生物技术有限公司) 裂解,BCA 法测定蛋白浓度。每个样品取20μg 蛋白经SDS-PAGE分离,然后按常规免疫印迹方法检测Nrf2的蛋白水平。结果表明Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可促进Nrf2蛋白质积累(图3),激活Nrf2-ARE通路,进而上调抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物,保护机体免受毒物的损伤。因此,Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2-ARE通路密切相关疾病治疗的药物或功能产品。
[0033] 最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。