发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种利用金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备抗氧化活性强、可清除自由基和抑制脂质过氧化作用、具有铁螯合功能的生产制造用途。
[0005] 该金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽，其特征在于该抗氧化铁螯合肽的氨基酸序列为Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp(YIVYW)，ESI-MS检测分子量为742.84Da。
[0006] 其制备方法，包括以下步骤：
[0007] 1)金枪鱼暗色肉的预处理：取金枪鱼暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:3～5mL加入异丙醇，室温下脱脂20～24h，然后于4℃、9000rpm离心25～30min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；
[0008] 2)脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g:20～25mL加入磷酸盐缓冲液(pH 6.5～7.5)，得混合液；将混合液温度升至55～65℃预热5～10min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.0％加入蛋白酶，酶解温度为55～65℃，酶解3～5h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，10000g离心20～
25min，取上清液，即为酶解产物；
[0009] 3)金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到抗氧化铁螯合肽。
[0010] 作为优选，所述步骤1)中的金枪鱼为鲣鱼(Katsuwonus pelamis)。
[0011] 作为优选，所述步骤2)中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥1.0×105U/g。
[0012] 作为改进，所述步骤3)中的凝胶过滤层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
[0013] 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析(2.6×80cm)分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基(DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基)清除活性最高组分为凝胶层析酶解物。
[0014] RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp(YIVYW)，ESI-MS检测分子量为742.84Da。
[0015] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱Zorbax SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温为25～30℃；流动相：A含0.1％三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脱：0-6min为水，6min以后乙腈浓度每分钟升高0.5％；洗脱速度0.8～1.0mL/min；紫外检测波长220nm。
[0016] 本发明所制备的金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp(YIVYW)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp(YIVYW)亦显示出显著的铁螯合作用。Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp(YIVYW)具有安全无毒副作用、抗氧化铁螯合活性强、易于消化吸收等优点，可以应用于抗氧化和补铁相关的药品和功能产品。
