发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种对革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)均有抑菌作用的带鱼肝脏抗菌肽。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种带鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)，ESI-MS检测分子量为983.15Da。
[0006] 该带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，可以通过以下方法制备：
[0007] 1)带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀浆，然后按照固液比1g：8～10mL加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 6.5～7.5)混匀，加热至20～30℃，在功率为900W，频率为30～50kHz超声波发生器内超声提取90～120min，按照肝脏质量的0.3～0.5％加入中性蛋白酶(酶活力≥2.0×104U/g)，于温度55～65℃下酶解6～8h，10 000r/min离心25～30min，取上清液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物；
[0008] 2)带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
[0009] 作为优选，所述步骤1)中的带鱼为带鱼(Trichiurus haumela)。
[0010] 作为优选，所述步骤2)中的大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备的具体过程为：
[0011] 大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10～15mg/mL溶液，以2～3mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积75％乙醇进行洗脱，洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂制备酶解物。
[0012] 凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为10～15mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物。
[0013] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80～100μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。
[0014] RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的抑制率得1个高活性抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)。
[0015] 优选，所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的细胞膜；进样量为15～20μL；细胞膜色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温为37℃；流动相为三蒸水；紫外检测波长225nm；流速为0.3～0.5mL/min。
[0016] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量为15～20μL；色谱柱为Zorbax C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为20％乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱速度为0.8～1.0mL/min；紫外检测波长为225nm。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0018] (1)本发明以带鱼肝脏为原料，提高了带鱼资源的利用率，减少了环境污染。
[0019] (2)本发明制备的抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)对革兰氏阴性菌(G-)(大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))和革兰氏阳性菌(G+)(金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea))均有较强的抑制作用。
