实施方案
[0019] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0020] 实施例：
[0021] 一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼碎肉→双酶酶解→酶解物→超滤→活性炭吸附→大孔树脂纯化→金枪鱼高F值寡肽→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→Nrf2-ARE通路激活剂。
[0022] （1）金枪鱼碎肉的酶解：取鲣鱼碎肉匀浆，按固液比1 g:12 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05mol/L，pH 9.5），用HCl或NaOH调节pH到9.3，将溶液温度调制60℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.2 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×105 U/g），酶解时间3.5 h后，酶解液于95℃保温12 min，灭酶活；将酶解液温度调至50℃，调节pH到7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.9%加入复合风味蛋白酶（酶活力≥1×103 LAPU/g），酶解时间3.0 h，酶解液于95℃保温15min后降至室温，于9000 rpm离心15 min，取上清液。
[0023] （2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至3.0，按照物料与活性炭颗粒比为12:1将超滤酶解液以0.3mL/min 流速缓慢加入到装载活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液，调pH值至7.0，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。
[0024] （3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2-ARE通路激活剂。
[0025] 作为优选，所述步骤3）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：
[0026] ①凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响，选择Nrf2蛋白质水平最高组分冻干，即为凝胶层析酶解物Fr.3（图1）。
[0027] ②反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化（条件为：进样量15 μL；色谱柱Kromasil C1（8 250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～40min乙腈浓度由0匀速升至50%）；洗脱速度
0.8 mL/min；紫外检测波长220 nm。），根据对Nrf2蛋白质水平的影响得1个活性多肽（图2）。
[0028] ③结构检测：收集对Nrf2蛋白质累计水平最高的多肽，经反相高效液相色谱检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI-MS测定分子量为658.76 Da。
[0029] 自由基清除实验：将制得的金枪鱼碎肉多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)进行自由基清除实验。实验结果表明：Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)对羟基自由基（EC50 0.12 mg/mL）和超氧阴离子自由基（EC50 0.06 mg/mL）具有良好的清除作用。
[0030] 抗氧化肽对激活Nrf2/ARE 通路的作用：取对数生长期的人胚肾细胞株HEK293 细胞接种于60mm 皿24 小时后，分别加入10μM的酶解液和Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，继续培养4 小时。弃去上清，细胞用RIPA 缓冲液( 上海碧云天生物技术有限公司) 裂解，BCA 法测定蛋白浓度。每个样品取20μg 蛋白经SDS-PAGE分离，然后按常规免疫印迹方法检测Nrf2的蛋白水平。
[0031] 与现在技术相比，本发明所提供的一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；可促进Nrf2 蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物，保护机体免受氧化应激产生的活性氧的损伤；可用作制备肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf2-ARE通路密切相关的疾病的药品或保健食品。
[0032] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
