发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法，使得其制备率与再生率都达到较高范围。
[0007] 本发明所采用的技术方案如下：
[0008] 一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，按照下述步骤进行：
[0009] （1）菌种活化培养：
[0010] 将保藏的菌株T1 （Bacillus sphaericus）重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中8 9
纯培养至对数期，约为10-10个/ml；
[0011] （2）原生质体的破壁酶解：
[0012] 取4 ml活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.2-1.8ml的SMM缓冲液重悬；加入0.1-1 mg/mL的溶菌酶0.2-0.8ml和2 ml加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解0.5-1.5 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 ml 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；
[0013] （3）原生质体的再生：
[0014] 取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，使得原生质体再生。
[0015] 其中所述的菌株T1 （Bacillus sphaericus）是从太湖河浜底泥中筛选出的1株降解MC-LR的球形芽孢杆菌，保藏号为CGMCC NO.4498。其保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC4498，建议的分类命名为：芽孢杆菌 Bacillus sp.。
[0016] 其中步骤（1）中所述的菌种活化培养用的培养基组成如下：（1）细菌培养基：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。
[0017] 其中步骤（3）中所述的原生质体的再生用的高渗液体培养基组成如下：蛋白胨10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g（0.5 mol/L），蒸馏水定容至1000 mL，pH
7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20-24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于
121℃条件下灭菌20 min。
[0018] 其中所述的溶液配制如下：（1）高渗NaCl溶液：NaCl 0.55 mol/L。（2）SMM缓冲液：蔗糖 0.55 mol/L，顺丁希二酸 20 mmol/L，MgCl2·6H2O 20 mmol/L，pH 6.8。（3）EDTA溶液：EDTA 0.8 g/L，SMM缓冲液配制。（4）溶菌酶：0.1 mg/mL，SMM缓冲液配制。上述溶液根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。
[0019] 上述原生质体制备与再生方法优选：加入溶菌酶使得体系中酶浓度为0.05 mg/ mL，在温度为30℃时酶解1h，该赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备率与再生率最佳，有利于后续融合子的制备与再生。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 采用本发明的原生质体制备与再生方法，工艺简单，便于操作，可重复性强；所获得的原生质体制备率最高可达96.64%，且再生率可达83.95%，原生质体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续融合子的制备与再生。
