[0046] 本发明提供了一种通过原生质体融合技术融合出的溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1，经鉴定其属于球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），并于2013年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO.7519。
[0047] 具体融合构建方法，包括如下步骤：
[0048] （1）亲本菌体活化
[0049] 将菌株T1、F8分别转接至平板划线分离2次，转接至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120r/min的振荡培养箱中分别培养24h、16h至对数期。
[0050] （2）亲本原生质体制备
[0051] T1菌株按照以下步骤进行：
[0052] a、菌体重悬：取4ml活化的菌液，4500r/min离心10min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次；
[0053] b、酶解：用1.8ml的SMM缓冲液重悬，加入1mg/mL的溶菌酶0.2ml和2ml加热至酶解温度的EDTA溶液，使得体系酶浓度达到0.05mg/mL，在水浴温度30℃条件下酶解1h；
[0054] c、原生质体重悬：3000r/min离心收集原生质体，用0.55mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4ml0.55mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；
[0055] F8菌株按照以下步骤进行：
[0056] a、菌体重悬：将4mL活化的菌液4500r/min离心10min，以SMM缓冲液洗涤2-3次后用SMM缓冲液重悬；
[0057] b、酶解：加入溶菌酶使得体系浓度达到5mg/L，水浴温度为33℃，保温酶解时间为30min；
[0058] c、原生质体重悬：3000r/min离心后以0.55mol/L的NaCl溶液洗涤原生质体2-3次，再用4mL0.55mol/L NaCl溶液重悬原生质体。
[0059] （3）亲本原生质体灭活
[0060] 将F8菌株的原生质体悬浮液放入水浴锅中恒温45℃保温30min灭活，分别采用热灭活与紫外灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活。其中，采用紫外灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活，用紫外灯（12W）进行照射，与点光源距离15cm，照射60min；采用热灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活，灭活温度分别为45、50、55、60℃，时间30min。
[0061] （4）亲本原生质体融合
[0062] 将不同灭活方式处理后的两亲本原生质体各取1mL于5mL灭菌离心管中，混匀后3800rpm离心20min，弃去上清液，加入新生磷酸钙溶液0.2mL并摇匀，加入1.8mL30%的PEG4000，酸碱度为8.0，30℃融合30min，后3800rpm离心10min，弃去上清液，用SMM溶液定容至2mL。
[0063] （5）双效工程菌融合子的传代与筛选
[0064] 将步骤（4）中的双效工程菌菌悬液梯度稀释后选取合适浓度涂布于高渗培养基，30℃恒温培养48h，观察细菌形态、大小，挑取不同形态大小的菌落重新转接至平板，划线分离4次，30℃恒温培养48h，观察菌落形态，以游标卡尺测量菌落直径并求平均值。对挑选出的大于亲本直径的菌株进行溶藻实验和藻毒素降解实验，F8和T1菌株为对照组。溶藻实验以1：10的菌藻比，12h：12h光照条件进行。对所筛选出的融合子，采用PCR扩增的方法对融合子进行分子鉴定。
[0065] 以下提供本发明利用上述方法构建溶藻/藻毒素降解双效工程菌的5个实施例：
[0066] 表1亲本灭活方式对融合子形成的影响
[0067] Table1 Effect of inactivated pattern on fusant formation
[0068]
[0069] 注：实施例1为F8菌株原生质体45℃热灭活，T1菌株原生质体紫外灭活；实施例2-5分别为F8菌株原生质体45℃热灭活，T1菌株原生质体45、50、55、60℃热灭活。
[0070] 其中，对F8采用45℃热灭活原生质体、T1原生质体紫外灭活后进行融合可达到31.97%的融合率。
[0071] 亲株原生质体在高渗条件下混合，以PEG促融，互相凝结融合后涂布于再生平板上，恒温培育48h后检出融合子，采用间接法，对再生培养基上长出的菌落用影印法复制，观察融合子的生长状况，并与亲株进行比较，结果如表2所示。
[0072] 表2 融合子生长状况
[0073] Table2 Development of fusant
[0074]
[0075]
[0076] 由表2可知，融合子直径大于亲本的有#1、#5、#6、#7、#9、#14、#15、#16、#18、#19。选择这10株菌株进行进一步筛选，以获得兼具溶藻与藻毒素降解功能的目标融合子，为便于记录，将这10株融合子依次分别命名为Y1～Y10。
[0077] 对初筛得到的融合子Y1～Y10进行溶藻试验研究，与双亲株F8和T1进行比较，并以不加菌液的铜绿微囊藻液为空白对照，chla剩余含量及其去除率如图1、图2所示。
[0078] 对比双亲株对铜绿微囊藻的去除效率可知，Y1、Y7、Y8、Y9、Y10对chla的5d去除率高于亲株F8和T1，其去除率分别为63.58%、48.53%、44.77%、48.12%、39.44%，鉴于Y10溶藻效率较低，以Y1、Y7、Y8、Y9做进一步藻毒素降解性能的研究。
[0079] 对溶藻效果优于亲株的菌株Y1、Y7、Y8、Y9，研究其藻毒素降解性能，并与亲本比较，获得的优于亲株藻毒素降解性能的菌株即为以原生质融合法构建的兼具溶藻及藻毒素降解功能的目标双效工程菌，实验结果如图3所示。
[0080] 亲株F8、T1与融合菌株Y1、Y7、Y8、Y9对藻毒素均具有一定的降解效果。其中，Y7对MC-LR的降解效果最好，可达40%，Y1为27.92%，均高于亲株F8、T1的MC-LR降解效果。综上所述，可以初步推断Y1与Y7是融合出的兼具溶藻与MC-LR降解功能的双效工程菌。
[0081] 高质量的DNA是成功进行PCR扩增的保证，图4为琼脂糖凝胶电泳实验结果，由图可知，提取的基因组DNA质量较好，左数第2泳道为Y1菌株基因组DNA，条带清晰，无杂带，分子量大于15000bp。
[0082] 以提取的Y1基因组DNA为模板，P1、P2为上下引物，PCR扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5左数第2泳道所示，约为1400bp。
[0083] PCR扩增产物利用上海杰瑞生物工程有限公司的DNA快速回收试剂盒纯化后委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测定，双向测通，所获得Y1的16SrDNA序列如图6所示，序列长度为1462bP。
[0084] 通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST程序搜索可得到与待测序列具有较高相似度的不同物种的已知菌株序列，并在NCBI网上比对后选择与Y1菌株具有较高相似度的菌株构建系统发育树，结果如图7所示。
[0085] 按照国际分类委员会的建议，DNA同源性以70%为界，大于或等于70%即为同一个种群，小于70%为不同的种群。由图7系统进化表明，Y1与T1亲缘关系最近位于一个分支，自展值为89，由此推断Y1类似于于亲株T1，归属于芽孢杆菌属。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC NO.7519。
