[0030] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0031] 生物材料来源：Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5，中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。
[0032] 实施例1：可用于琼寡糖水解的基因Gal1265基因的获得
[0033] 将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD600为1‑1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA。上述人工海水培养基配置方法如下：
[0034] 人工海水培养基：牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl37.51g、KCl 1.03g、CaCl2 1.61g、MgCl2·6H2O 6.4g、NaHCO3 0.15g、MgSO4·7H2O 4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。
[0035] 实施例2：序列分析与引物设计
[0036] 利用SignalP 4.1Server分析gal1265基因序列，获得信号肽位置，并在后续构建重组质粒及表达中去除信号肽。利用DNAMAN软件对基因序列进行分析，获得合适的酶切位点。设计引物如表1。
[0037] gal1265‑F序列如下：
[0038] 5′‑CGCGGATCCAACTCACTACAGCACATAATTAATC‑3′SEQ ID NO:3,
[0039] gal1265‑R序列如下：
[0040] 5′‑CCGCTCGAGTTTAGCCGAAAAAGTTAAAGAGTAG‑3′EQ ID NO:4。
[0041] 下划线分别为BamHI和XhoI酶切位点。
[0042] 实施例3：基因Glu525在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的中的重组表达和纯化[0043] β‑半乳糖苷酶基因的PCR扩增：以实施例1所得到的ASY5菌株基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。
[0044] PCR反应体系为：5×PrimeSTAR缓冲液10μL，10mmol/L的4种dNTPs混合液4μL，基因特异性上游引物(即gal1265‑F)1μL，基因特异性下游引物(即gal1265‑R)1μL，Primer STAR enzyme 0.5μL，基因组模板1μL(<200ng)，加无菌水补足至50μL。
[0045] PCR扩增程序为：预变性(95℃，5min)；变性(94℃，15s)，退火(56℃，15s)，延伸(72℃，3min20 s)30个循环；终延伸(72℃，10min)。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。利用DNA纯化试剂盒回收目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，‑20℃保存，结果如图1所示。其中泳道M为DL5000 marker，泳道1为PCR扩增产物。由图1可知，PCR扩增产物在3000bp附近出现特异性条带，符合目的条带的理论大小。
[0046] PCR扩增产物回收：参照广东东盛生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化PCR产物，测定回收产物的浓度，保存于‑20℃备用。
[0047] 目的基因和载体的双酶切：用无菌超纯水将纯化后的目的基因及pET‑28a载体稀释至浓度一致，在PCR管中加入表1中的成分，混匀后短暂离心，将液体集中于管底。37℃酶切12h。酶切产物用凝胶回收纯化试剂盒纯化回收，‑20℃保存备用，酶切电泳结果如图2所示。其中泳道M为DL5000 marker，泳道1为环状质粒；泳道2为线性化质粒。从图中可看出，泳道1迁移率大于泳道2，证明酶切成功，酶切产物可用于后续连接。
[0048] 表1双酶切反应体系表
[0049]
[0050] 目的基因与载体的连接：在0.5mL离心管中加入表2中的成分，混匀后短暂离心，将液体集中于管底，16℃连接16h。
[0051] 表2连接反应体系表
[0052]
[0053] 转化至克隆宿主及筛选：
[0054] (1)参照说明书转化E.coli DH5α感受态细胞。
[0055] (2)挑取阳性转化子单菌落至新鲜液体LB培养基(含50μg/mL Kana)，37℃培养过夜后，进行菌落PCR验证，菌落PCR体系及程序如表3及表4所示。
[0056] (3)琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR扩增产物。
[0057] (4)为进行进一步验证，将验证正确的阳性转化子送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。
[0058] (5)测序符合要求的转化子制作甘油管保种。
[0059] 表3菌落PCR反应体系表
[0060]
[0061]
[0062] 注：上游引物为gal1265‑F，下游引物为gal1265‑R。
[0063] 表4PCR反应程序表
[0064]
[0065] 注：30个循环。
[0066] 重组质粒的提取：将筛选到的阳性转化子转接至液体LB培养基(含50μg/mL Kana)中，37℃培养过夜后，参照生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒提取试剂盒说明书的步骤操作，即得重组质粒pET‑28a‑gal1265，结果如图3所示，其中泳道M为DL5000 marker，泳道1‑5为重组质粒。从图3可以看出，1‑5均为阳性克隆，提取出阳性克隆的重组质粒委托铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序，测序结果显示，目的片段正确插入载体中，表明已成功构建表达载体pET‑28a‑gal1265。
[0067] 转化至表达宿主及筛选：转化及筛选方法同上。验证正确的E.coli BL21(DE3)转化子制作甘油管保种，用于后续重组蛋白表达。
[0068] 重组基因Gal1265的诱导表达：将上述保种的阳性转化子转接于200mL LB液体培养基(含Kana 50μg/mL)，37℃培养至OD600值达0.5–0.6。加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，16℃低温诱导表达20h，用于后续的亲和层析纯化。
[0069] 重组基因Gal1265的纯化：将上述诱导表达的菌液于6500rpm，4℃下冷冻离心20min，弃上清，收集菌体沉淀。参照GE Healthcare公司的Ni‑NTA Sepharose使用说明书纯化目的蛋白。取适量样品进行SDS‑PAGE检测，结果如图4所示。其中泳道M为蛋白marker，泳道1‑2为纯化蛋白。结果显示，经纯化后得到条带单一的重组蛋白(道1，2)，分子量约为
117kDa，符合理论分子量大小。
[0070] 实施例4：重组基因Gal1265酶学性质分析
[0071] 重组酶活力的测定：向1.5mL离心管中加入190μL 10mM ONPG(溶于50mM Tris‑HCl，pH＝7.0)，在一定温度下保温5min，再加入酶液10μL，反应10min后加入200μL 1mol/L Na2CO3终止反应，测定420nm吸光值。酶活定义：每分钟生成1μmol ONP所需的酶量为一个酶活单位(U/mL)。
[0072] 温度对酶活性及稳定性的影响：重组基因Gal1265的最适反应温度测定是以10mM ONPG为底物，研究温度为5℃‑60℃时重组酶的活力，将最高酶活力定义为100％；通过将重组基因Gal1265在25℃、30℃和35℃处理不同时间后检测其残余酶活来研究重组酶的热稳定性。将未经热处理的酶活力定义为100％。结果见图5，其中a为重组基因Gal1265最适温度；b为重组基因Gal1265 25℃热失活曲线；c为重组基因Gal1265 30℃热失活曲线；d为重组基因Gal1265 35℃热失活曲线。结果如图5的a所示，重组基因Gal1265在5℃‑55℃范围内均有活性，最适反应温度为30℃。当温度高于30℃酶活明显降低，在15℃‑30℃范围内，酶活可达最大活力的40％以上，在5℃仍有接近20％的活力，Gal1265具有低温酶特点；图5的b，重组β‑半乳糖苷酶在25℃保温3.5h，酶活基本不变，3.5h后酶活缓慢下降，保温7h仍能保持65％以上的酶活力；图5的c，在30℃条件下，前20min酶活损失约30％的酶活力，之后保温直到1h内，酶活能保持50％以上；图5的d，在35℃条件下，前5min酶活损失约60％，30min后酶活几乎全部丧失。
[0073] pH值对酶活性及稳定性的影响：测定最适pH时，用不同pH的缓冲液配制0.5％(w/v)海藻酸钠，在最适反应温度下测定酶活，以最高酶活100％。缓冲液分别为50mM的乙酸‑乙酸钠(pH 4–6)、磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠(pH 6–8)、Tris‑HCl(pH 8–9)和甘氨酸‑NaOH(pH 9–10)。通过测定酶液在不pH条件下4℃放置24h后的残余酶活来研究pH稳定性，以未处理的酶活力为100％。结果见图6，其中a为基因Gal1265最适pH；b为基因Gal1265pH稳定性。结果如图6的a所示，重组基因Gal1265在Gly‑NaOH缓冲体系中酶活力最高，其最适反应pH为8.5，在pH 8.0‑9.0范围内具有最高酶活80％以上的酶活力；图6的b，重组β‑半乳糖苷酶在酸性至偏碱性(pH 5.0‑9.0)范围内相对稳定，4℃处理24h后仍能保持60％以上的酶活力，pH高于9条件下，活力完全丧失。以上结果表明，此重组β‑半乳糖苷酶具有较为宽广的pH适应范围。
[0074] 金属离子对重组基因Gal1265酶活的影响：通过测定酶液在4℃被不同金属离子+ + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+(Na、K 、Ca 、Mg 、Ba 、Cu 、Mn 、Cd 、Al 和Fe ，1mM或10mM)处理1h后的残余酶活，来研究金属离子对酶活力的影响，以未被金属离子处理的酶活力为100％。结果如图7所示，图7为金属离子对重组基因Gal1265的影响图。可以看出：K+、Na+、Mg2+、Mn2+能明显促进酶活，其中1mM的Mn2+促进作用最强，使酶活提高了49.46％，Cd+及10mM的Cu2+、Zn2+几乎能完全
2+ 3+ 3+ 2+ 3+ 3+
抑制酶活，1mM的Ba 、Fe 和Al 对酶活有轻微促进作用，10mM的Ba 、Fe 和Al 则抑制酶活。结果如图8所示，图8为NaCl和KCl对重组基因Gal1265的影响图。可以看出：Gal1265对K+有较强的耐受性，添加800mM的K+对酶活仍有促进作用，40mM的K+对酶活促进作用最强，提高了159.59％。Na+对Gal1265呈现低浓度促进，高浓度抑制的趋势，添加160mM的Na+促进作用最强，酶活提高了45.30％，当Na+浓度高于240mM时，开始呈现抑制效果，但仍能保持70％以上的活力。
[0075] 抑制剂和表面活性剂对重组基因Gal1265活力的影响：在酶液中分别添加终浓度为1mM或10mM抑制剂(EDTA、CTAB、Urea)和1％(w/w或w/v)或10％(w/w或w/v)表面活性剂(SDS、Tween‑20、Tween‑80、Triton X‑100)，4℃处理1h后，测定酶的剩余活力，以未添加抑制剂或去垢剂的酶活力为100％，研究抑制剂和去垢剂对酶活性的影响。结果如图9所示，图9为抑制剂和表面活性剂对重组基因Gal1265的影响图。可以看出：Gal1265对表面活性剂中的Triton X‑100、Tween‑20和Tween‑80具有很好的抗性，低浓度的SDS能轻微促进酶活，CTAB对Gal1265的抑制作用较强，在浓度为1％时，Gal1265基本失活，抑制剂EDTA对Gal1265有较强的抑制作用，1mM EDTA几乎能完全抑制酶活，尿素能轻微促进酶活。
[0076] 实施例5：基因Gal1265的琼寡糖水解作用
[0077] Gal1265对琼寡糖水解活力的测定：反应体系包括浓度为2mg/mL的寡糖溶液100μL，加入纯化后的酶液100μL，在30℃反应24h后取样进行TLC。
[0078] 用50mM Tris‑HCl缓冲液(pH 8.0)配制5mg/mL的海藻酸钠溶液。取上述溶液50mL，加入5mL酶液，于55℃下反应，每小时补加5mL酶液，并测定体系中的还原糖含量。当还原糖含量稳定时，沸水浴灭活10min，10,000r/min，4℃离心20min，收集上清液。加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置2h，离心取上清，然后将上清旋转蒸发浓缩后冻干，得到重组基因Gal1265降解的新琼寡糖。利用TLC技术分析酶降解琼寡糖的成分。展开剂为正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1(v/v/v)。显色剂为10％浓硫酸的乙醇溶液(每100mL显色剂添加0.5g百里酚)。结果如图10所示，图10为通过重组基因Gal1265水解AOSs和NAOSs的反应产物的TLC分析图。a中1为D‑半乳糖；2为琼三糖；3为酶解后琼三糖；4为琼五糖；5为酶解后琼五糖；6为琼七糖；7为酶解后琼七糖。B中1为D‑半乳糖；2为新琼二糖；3为酶解后新琼二糖；4为新琼四糖；5为酶解后新琼四糖；6为新琼六糖；7为酶解后新琼六糖。可以看出：Gal1265能作用于以D‑Gal为非还原端的AOSs(比如琼三糖、琼五糖和琼七糖)，而不能作用于以AHG为非还原性末端的NAOSs(比如新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖)。反应24h后，新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖无变化。琼三糖、琼五糖和琼七糖基本被转化为D‑Gal和另一较小分子的糖。
[0079] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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