[0108] 一、引物设计
[0109] 根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因(Bm‐myosin)的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基，引物由上海生物工程公司合成。
[0110] P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’
[0111] 下划线序列为BamHⅠ酶切位点 Tm＝56.84
[0112] P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’
[0113] 下划线序列为XhoⅠ酶切位点 Tm＝66.90
[0114] 二、周期型马来丝虫虫体及微丝蚴的收集和总RNA的提取和测定
[0115] 1.将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蚴移入1.5ml匀浆器中,加入1mlTrizol试剂充分研磨,室温静置5min。
[0116] 2.加入0.2ml氯仿,震荡15s后静置2min,4℃,12000rpm离心15min取上清。
[0117] 3.加入0.5ml异丙醇混匀,室温静置10min,4℃,12000rpm离心10min弃上清。
[0118] 4.加入1ml 75％乙醇混匀,4℃,9000rpm离心5min弃上清。
[0119] 5.干燥5min后溶于DEPC处理水30ul,60℃10min。
[0120] 6.取2ul总RNA稀释200倍,在紫外分光光度计上测OD260和OD280值,确定其浓度和纯度,并进行甲醛电泳检测。
[0121] 三、cDNA的合成
[0122] 1.取总RNA 5ul,后加入10mM dNTPmix 1ul,0.5ug/ul oligo(dT)12‐18ul,DEPC处理水3ul,65℃加热5min,后冰浴5min。
[0123] 2.另取10×Buffer 2ul,25mM MgCl2 4ul,0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制剂1ul混匀,42℃孵育2min。
[0124] 3.将步骤2混合液加入步骤1混匀,再加入1ul逆转录酶SuperscriptⅡ混匀，42℃孵育50min,70℃15min终止反应,‐70℃保存备用。
[0125] 四、PCR扩增Bm-myosin基因
[0126] P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1 P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul。混匀在DNA扩增仪PTC‐100上进行PCR。循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应。同时设立阴性对照。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0127] 五、Bm-myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化
[0128] 1.纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物。
[0129] 2.感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜。挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜。取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离,8000rpm 5min。弃上清,加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm 5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用。
[0130] 3.Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体(50ng)1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h。
[0131] 4.转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min。将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养。
[0132] 六、阳性重组克隆的筛选和鉴定
[0133] 1.阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒。
[0134] 2.PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1 P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1 P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O15.4ul。循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为
7min,4℃冷却终止反应。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0135] 3.酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
[0136] 七、Bm-MYOSIN二级结构预测
[0137] 分别应用EXPASY服务器(http://www.expasy.ch/tools)上的SOPMA、GOR、nnPredict(University of California at SanFrancisco(UCSF))、HNN(Hierarchical NeuralNetwork method，Guermeur，1997)方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构。
[0138] 八、Bm-MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测
[0139] 采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测(http://www.expasy.org/cgi‐bin/protscale.pl)[0140] 九、Bm-MYOSIN T细胞表位预测
[0141] 1.人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果。
[0142] 2.鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d(包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子)，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果。
[0143] 3.人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果。
[0144] 4.鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果。
[0145] 十、表位基因片段的选择
[0146] 根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段(562bp‐1269bp)设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29。应用Primer 5软件设计引物。
[0147] 上游(P1)：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’
[0148] (其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点)；
[0149] 下游(P2)：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
[0150] (其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点)。
[0151] 引物由上海生工生物技术有限公司合成，使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L。
[0152] 十一、表位基因片段PCR扩增
[0153] 1.以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1。
[0154] 表1 PCR扩增反应体系
[0155]
[0156]
[0157] 扩增反应参数为：
[0158]
[0159] 取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因。
[0160] 十二、目的基因与载体连接与鉴定
[0161] 1.PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系见表2。
[0162] 表2双酶切反应体系
[0163]
[0164] 目的基因与载体连接，具体反应体系见表3。
[0165] 表3目的基因与载体连接反应体系
[0166]
[0167]
[0168] 混匀，室温反应30min以上，产物用于转化。
[0169] 2.E.coli DH5α感受态细胞的制备
[0170] (1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养约14‐16h至单菌落出现。
[0171] (2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养约10‐12h。
[0172] (3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养约2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min。
[0173] (4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min。
[0174] (5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min。
[0175] (6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min。
[0176] (7)用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃。
[0177] 3.转化及鉴定
[0178] (1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
[0179] (2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动。
[0180] (3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min。
[0181] (4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min。
[0182] (5)5000rpm离心1min。
[0183] (6)弃部分上清，混匀后倒在LB平板(含Amp)上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h。
[0184] (7)用白枪头挑单克隆至5ml LB液(含Amp)，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间。
[0185] (8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应。
[0186] (9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定。
[0187] (10)选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后送上海英骏生物技术有限公司进行测序。
[0188] 十三、BmM29表位基因真核表达载体构建
[0189] 纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ的克隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜。取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp(100mg/ml)平板上,37℃过夜培养。从LB‐Amp(100mg/ml)平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0190] 十四、BmM29表位基因疫苗免疫应答试验
[0191] 1.pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)‐BmM29质粒大量抽提
[0192] (1)取100ml过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量弃尽上清。
[0193] (2)12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出。
[0194] (3)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬浮，无小菌块。
[0195] (4)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液2，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置5min。
[0196] (5)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液4，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置10min，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离心管中。
[0197] (6)向滤液中加8ml异丙醇，混匀后转移到吸附柱，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。
[0198] (7)向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。
[0199] (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。重复一次。
[0200] (9)将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体。
[0201] (10)吸附柱置于干净的50ml收集管，加1ml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离心2min。
[0202] (11)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为1mg/ml，‐20℃保存备用。
[0203] 2.免疫佐剂CpG ODN的制备
[0204] 新型佐剂中以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)最具代表性。CpG ODN合成的序列如下：CpG ODN 1826 5′‐TCCATGACGTTCCTGACGTT‐3′，并全链硫代磷酸骨架修饰来增强其核酸酶抗性，由上海英骏生物公司合成。用生理盐水溶解配制成1mg/ml。
[0205] 3.实验动物分组
[0206] 将48只BALB/c实验小鼠称量体重排序，按照随机数字表法分4组，每组12只，A：PBS对照组；B：佐剂CpG对照组；C：空载体pcDNA3.1(+)/CpG组；D：重组质粒pcDNA3.1(+)‐BmM29/CpG组，免疫方案为0、2、4周各免疫一次。
[0207] 4.接种部位预处理
[0208] DNA疫苗注射部位为小鼠后腿胫前肌，重组蛋白疫苗为皮下多点注射。将lml左旋盐酸布比卡因注射液稀释到14ml生理盐水中，得到0.5mg/ml稀释液。每次接种前24h，于接种部位注射左旋盐酸布比卡因50μl进行预处理。
[0209] 5.免疫接种
[0210] A：PBS 100μl；B：佐剂CpG 30μg；C：pcDNA3.1(+)/CpG 100μg/30μg；D：pcDNA3.1(+)‐BmM29/CpG 100μg/30μg。共免疫3次，每次间隔2周。
[0211] 十四、免疫应答反应检测
[0212] 1.血清采集：分别于初次免疫后4、6、8周用眼球摘除法收集小鼠血清，每组取4只小鼠。室温静置1h，置4℃过夜，待析出血清，4℃，4000rpm离心10min。分装血清，贮存于‐80℃。
[0213] 2.免疫小鼠血清中IgG检测
[0214] (1)抗原包被：用抗原包被缓冲液将抗原稀释成5μg/mL，以100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；
[0215] (2)弃液体，用PBST洗涤3次。使用100μl/孔封闭液封闭，室温静置1h；
[0216] (3)弃液体，血清用抗体稀释液按照1:100比例稀释后，100μl/孔，室温2h；
[0217] (4)用PBST洗涤3次；
[0218] (5)用样品稀释液1:2000稀释HRP偶联的IgG抗体后，100μl/孔，室温1h；
[0219] (6)使用PBST洗涤3次；
[0220] (7)加入100μl/孔底物液，作用15min后，加50μl 2mol/L H2SO4终止反应；
[0221] (8)在450nm处测定吸光值，保存数据。
[0222] 3.小鼠脾细胞采集
[0223] (1)初次免疫后8周处死小鼠；
[0224] (2)取无菌10ml螺口管，加入3ml淋巴细胞分离液，37℃预热2h；
[0225] (3)将处死的小鼠置75％乙醇溶液中2‐3min进行消毒；
[0226] (4)将小鼠左腹侧朝上，用镊子将小鼠左腹部皮肤轻轻提起，用手术剪剪出约1cm长刀口，用手将腹部皮肤撕开，暴露腹膜，可见红色长条状脾脏，将其小心分离。
[0227] (5)将100目铜筛放入盛3ml Hank′s液的平皿中，将脾脏放在铜筛上，先将脾脏撕碎，再用玻璃棒轻轻研磨，直至铜筛上只剩下结缔组织，再用3ml Hank′s液冲洗铜筛；
[0228] (6)将含3ml淋巴细胞分离液的螺口管倾斜45°，用滴管将平皿中的细胞悬液沿管壁缓慢转移(淋巴细胞分离液:细胞悬液＝1:2)，不要冲破淋巴细胞分离液的界面；
[0229] (7)室温2000rpm离心20min，管中液体分为4层；
[0230] (8)取白色的第2层，转移至含10ml Hank′s液的50ml离心管中，室温1000rpm离心10min；
[0231] (9)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，室温1000rpm离心10min；
[0232] (10)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，用计数板计数；
[0233] (11)室温1000rpm离心10min，弃上层液体，加入适量完全培养基使得细胞的终浓度为2×106cells/ml。
[0234] 4.细胞因子的诱生
[0235] 24孔板加入2×106cells/ml细胞悬液475μl/孔，每孔各加100μl/ml ConA 25μl至终浓度为5μg/ml，5％CO2培养箱中37℃孵育48h。5000rpm离心10min收集培养液，取上清准备检测。
[0236] 5.INF‐γ和IL‐4含量测定
[0237] (1)提前20min取出保存在4℃的ELISA试剂盒，平衡至室温；
[0238] (2)将浓缩洗涤液用ddH2O稀释20倍；
[0239] (3)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，加入标准样品(160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、0pg/ml)各50ul；
[0240] (4)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，除空白孔外，分别加入样品稀释液40ul和待测样品10ul；
[0241] (5)除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min；
[0242] (6)弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
[0243] (7)每孔先加入显色剂A、B各50μl，37℃避光孵育15min；
[0244] (8)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
[0245] (9)计算OD值：每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值；
[0246] (10)绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应的OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线；
[0247] (11)通过样品的OD值可在标准曲线上查出该样品的浓度。
[0248] 6.数据分析
[0249] 应用SPSS19.0统计学软件分析样本数据，计量资料以均数±标准差表示，小鼠血清抗体的OD450值、小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN‐γ和IL‐4水平的组间比较比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK(Student‐Newman‐Keuls)法。P<0.05为差异有统计学意义。
[0250] 表4免疫小鼠血清抗体OD450值测定
[0251]
[0252] 注：*表示与三个对照组分别比较，差异有统计学意义，P＜0.05。
[0253] 表5不同免疫分组小鼠细胞因子INF‐γ和IL‐4水平(pg/ml)
[0254]
[0255] 注：*表示与三个对照组分别比较，差异有统计学意义，P＜0.05。
[0256] 通过试验成功地扩增出周期型马来丝虫myosin基因片段。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测,Bm‐myosin扩增片段大小与预期的1292bp基本相符。基因测序与GeneBank上提供的序列blast比较的结果,同源性为98％，证明克隆片段正确。其表达蛋白为431个氨基酸。综合Bm‐MYOSIN蛋白的二级结构预测和亲水性、表面可及性、极性及柔韧性参数等B细胞表位预测结果，以及T细胞表位预测研究结果，选择富含抗原表位的基因片段(562bp‐1269bp)，将真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒与BmM29目的基因片段连接，构建pcDNA3.1(+)‐BmM29真核表达载体，制备出周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗。
[0257] 将该表位基因DNA疫苗免疫接种BALB/c小鼠后腿胫前肌，对免疫小鼠进行疫苗免疫效果检测，测定免疫小鼠血清中IgG和脾细胞细胞因子INF‐γ和IL‐4含量。结果显示：免疫小鼠产生高水平特异性IgG抗体，明显高于对照组(P均＜0.05)。随着免疫次数的增加，免疫小鼠IgG抗体的OD450值呈上升趋势。免疫细胞因子检测结果显示：免疫组小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN‐γ和IL‐4的水平均明显高于对照组，有显著统计学意义(P均<0.05)。以上实验结果证明周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗免疫接种可诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答反应，取得满意效果。周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备获得成功。
