[0049] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0050] 实施例1
[0051] UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+材料的制备方法,包括以下步骤:
[0052] S1:称取21mg氯化锆(ZrCl4)溶解在3mL N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中,超声溶解20‑30分钟;
[0053] S2:称取43.4mg 2‑氨基‑对苯二甲酸(NH2‑H2BDC)溶解在1mL N,N‑二甲基甲酰胺中,超声溶解8‑10分钟;
[0054] S3:将S1步骤和S2步骤获得的溶液进行混合并逐滴加入2.5mL冰醋酸,搅拌20‑30分钟,使混合均匀;
[0055] S4:将含有氯化锆,2‑氨基‑对苯二甲酸,冰醋酸的混合液加入到20mL的反应釜中,然后将高压反应釜加热120℃保持24h,待反应釜冷却至室温,产物用N,N‑二甲基甲酰胺,乙醇分别各清洗三次,然后在真空干燥箱中80℃下干燥12小时,得到UiO‑66‑NH2材料。其SEM图如图2A所示,从图中可以看出UiO‑66‑NH2呈规则的八面体结构,粒径大约100nm且大小均一;
[0056] S5:称取20mg UiO‑66‑NH2和2mg三(2,2'‑联吡啶)二氯化钌溶于10mL N,N‑二甲基甲酰胺,将混合液在90℃下搅拌12小时,然后将获得的产物经离心后分别用N,N‑二甲基甲酰胺,乙醇各清洗三次,然后在真空干燥箱中80℃下干燥12小时,即可得到含有信号分子的2+ 2+
UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 材料。其SEM图如图2B所示,从图中可以看出UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3呈八面体结构,说明三(2,2'‑联吡啶)二氯化钌对UiO‑66‑NH2结构几乎没有影响。同时,
2+
UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 的元素分布图(图2D‑I)与EDS也证明了材料的合成。从图4中的XRD
2+
和FT‑IR表征也可以看出Ru(bpy)3 对UiO‑66‑NH2的结构没有影响,也再次证明了UiO‑66‑
2+
NH2/Ru(bpy)3 材料的成功制备。
[0057] 实施例2
[0058] 一种基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器的制备方法,包括以下步骤:
[0059] S1:称取2mg UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+材料溶于100μL、0.1M PH=7.4 PBS缓冲液2+
中,超声8‑10分钟使混合均匀,得到含有UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 材料的缓冲溶液;
[0060] S2:玻碳电极先依次用0.3和0.5μm的铝粉进行抛光处理,再依次放入体积比HNO3:H2O=1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中,进行超声波清洗,超声清洗的时间分别为3~5min。
2+
再取10μL含有UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 材料的缓冲溶液滴加在抛光的玻碳电极上,自然晾干后,在其表面滴加3μL 5%质量浓度的nafion溶液用于固定材料,得到修饰了UiO‑66‑NH2/
2+
Ru(bpy)3 的玻碳电极;
[0061] S3:将2.5OD的SDNA1、apt1序列分别溶解在0.1M PH=7.4的PBS缓冲溶液中得到浓度为100μM的SDNA1缓冲溶液和浓度为100μM apt1缓冲溶液,在4℃下保存备用;所述SDNA1、apt1序列分别为:
[0062] SDNA1:COOH‑ACACACCCAACCACACCAACCTGC;
[0063] apt1:SH‑TGTTGTGTTTGGGCAGGTTGGTGTGGTTGG;
[0064] S4:取15μL步骤S3得到的100μM apt1缓冲溶液加入到500μL金纳米粒子溶液中,在26℃下培养10h,制备成apt1‑金纳米粒子溶液;所述金纳米粒子溶液的制备方法为:100mL的圆底烧瓶中加入50mL的超纯水,加入0.5mL,1%氯金酸水溶液到圆底烧瓶中,使得溶液中氯金酸的浓度降到0.01%(w/v),将此溶液在油浴中加热恒温于92±4℃,在600‑800r/min的搅拌速率下,迅速加入2mL事先配制好的1%质量浓度的柠檬酸钠溶液,继续搅拌,最后溶液变成澄清的橙红色溶液,就制得了16nm左右的金纳米溶液;
[0065] 从图5A紫外吸收光谱中可以看出,apt1‑金纳米粒子(线b)的特征吸收峰与金纳米粒子(线a)相比发生红移,证明apt1‑金纳米粒子的成功制备;
[0066] S5:将步骤S2得到的修饰了UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的玻碳电极浸入1μM的SDNA1缓冲溶液中,在4℃下培养12h,随后将修饰电极浸入0.5%质量浓度的牛血清白蛋白溶液中培养1h后取出,并用PBS缓冲溶液清洗;
[0067] S6:将步骤S5得到的修饰电极浸入apt1‑金纳米粒子溶液中,在37℃下培养2h,用2+
PBS缓冲溶液清洗,即得基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 的适配体传感器。
[0068] 实施例3
[0069] 一种基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器检测凝血酶的可行性应用,具体检测方法为:
[0070] a、抛光处理的裸玻碳电极,不进行后续处理;
[0071] b、在抛光处理的裸玻碳电极上滴加10μL含有UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+材料的缓冲溶液,自然晾干后,在其表面滴加3μLnafion溶液(5%)用于固定材料,所获得修饰电极放在4℃下避光备用,进行电致化学发光检测;
[0072] c、抛光处理的裸玻碳电极修饰过程与步骤b相同,然后将得到的修饰电极浸入1μM SDNA1缓冲溶液中,在4℃下培养12h,随后进行电致化学发光检测;
[0073] d、抛光处理的裸玻碳电极修饰过程与步骤c相同,然后将得到的修饰电极浸入0.5%的牛血清白蛋白溶液中培养1h,进行电致化学发光检测;
[0074] e、抛光处理的裸玻碳电极修饰过程与步骤d相同,将获得的修饰电极浸入apt1‑金纳米粒子溶液中,在37℃下培养2h,进行电致化学发光检测;
[0075] f、抛光处理的裸玻碳电极修饰过程与步骤e相同,将获得的修饰电极浸入200μM含有凝血酶的缓冲溶液中,在37℃下培养1h,进行电致化学发光检测;
[0076] 将按着上述不同方法得到的裸玻碳电极和修饰玻碳电极分别浸入3mL含有10mM三丙胺(TPA)的0.1M PH=7.4的PBS磷酸盐缓冲液中,光电倍增管高压设置为500V,扫描电压范围是0V到1.4V,在室温下进行电致化学发光检测。检测结果如图6,裸玻碳电极(线a)并没2+
有ECL响应,当UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 修饰在电极上(线b),一个明显的ECL信号出现因为Ru
2+
(bpy)3 和共反应剂TPA的化学反应。当电极表面层层组装SDNA1(线c)和BSA(线d)后,ECL强度逐渐降低因为在电极表面形成了导电性较差的表层。然而当Au NPs‑apt1(线e)被组装到修饰电极表面后,ECL信号有了大的增强这是由于金纳米粒子的等离子共振效应。从图5B中
2+
Au NPs的紫外吸收曲线(线a)和UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 的ECL发射曲线(线b)有部分重叠也
2+
可以看出Au NPs对UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)3 的ECL强度具有等离子共振效应。当加入目标物凝血酶(线f)以后,凝血酶与适配体特异性结合,Au NPs逐渐从电极表面脱离,ECL强度有所减弱。
[0077] 实施例4
[0078] 一种基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器检测凝血酶的条件优化:
[0079] 根据实施例2构建基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器,将获得的修饰电极浸入200μM含有凝血酶的0.1M pH7.4的PBS缓冲溶液中,在37℃下培养1h,以3mL含有不同浓度的三丙胺(TPA)的0.1M pH7.4 PBS缓冲溶液作为电解液,并将修饰电极浸入电解液中,光电倍增管高压设置为500V,扫描电压范围是0V到1.4V,在室温下进行电致化学发光检测。改变电解液中三丙胺的浓度分别为4mM、6mM、8mM、10mM、12mM和14mM,检测电致化学发光信号,结果如图7A所示,当TPA的浓度是10mM时,ECL响应最好;
[0080] 根据实施例2中的方法构建基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器,将获得的修饰电极浸入200μM含有凝血酶的0.1M pH7.4的PBS缓冲溶液中,在37℃下培养1h,以3mL含有10mM三丙胺(TPA)的不同pH的0.1M PBS缓冲溶液作为电解液,并将修饰电极浸入电解液中,光电倍增管高压设置为500V,扫描电压范围是0V到1.4V,在室温下进行电致化学发光检测。改变电解液中PBS缓冲溶液的PH分别为6、6.5、7、7.4、7.5、8和8.5,检测电致化学发光信号,结果如图7B,从图中可见,在PBS缓冲溶液的PH值是7.4时,电致化学发光信号强度最大,表明PBS缓冲溶液最佳PH值是7.4。
[0081] 实施例5
[0082] 在实施例4中探索的最优实验条件下进行一种基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器检测凝血酶的应用,具体检测方法为:
[0083] a、根据实施例2构建基于UiO‑66‑NH2/Ru(bpy)32+的适配体传感器,将获得的修饰电极浸入200μM含有凝血酶的0.1M pH7.4的PBS缓冲溶液中,在37℃下培养1h,并将修饰电极浸入3mL含有10mM三丙胺(TPA)的0.1M PH=7.4的PBS磷酸盐缓冲液中,光电倍增管高压设置为500V,扫描电压范围是0V到1.4V,在室温下进行电致化学发光检测。其中,含有凝血酶的PBS缓冲溶液的浓度分别为:0.05fM(a),1fM(b),10fM(c),100fM(d),200fM(e),500fM(f),1pM(g),10pM(h),不同浓度凝血酶对应的ECL信号强度,如图8A所示;
[0084] b、以凝血酶的浓度为横坐标,所对应的ECL信号强度最大值为纵坐标,构建线性关系曲线如图8B所示,得到线性方程I=10516.33‑1780.44logC,其线性相关系数R为0.9902,其中I为ECL信号强度的最大值,C为凝血酶浓度,单位为fM;根据线性方程即可测试得到任意信号强度下对应的待测凝血酶浓度。
[0085] 上述参照实施例对一种适配体传感器及其制备方法和应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。