[0055] 下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
[0056] 在一个优选实施例中，一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及其应用，所述方法包括以下步骤：
[0057] (1)、一步法超声波合成单层二维二氧化锰纳米片，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟。
[0058] (2)、将购买的2.5OD FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中，得到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液；
[0059] (3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液，加入不同浓度的二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，得到“关闭”的荧光生物传感器。
[0060] (4)、在步骤(3)中得到的混合液中，加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，得到“开”的荧光生物传感器。
[0061] 步骤(1)为：高锰酸钾浓度为10mM，吗啉乙磺酸缓冲溶液为0.1M，pH＝6.0，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟，形成棕褐色溶液，将超声后的混合液先7000rpm离心15分钟后，用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物，再将沉淀在60℃干燥，最后，将沉淀超声分散在50ml去离子水中，在4℃下保存备用；步骤(2)为将10μL 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲溶液得到500nM溶液，4℃下保存备用；将够买的碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12且含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释得到2500U/ml，-4℃下保存备用；步骤(3)为取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，室温下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上，FAM的荧光被猝灭；步骤(4)为加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸，还原二氧化锰纳米片，释放出FAM-DNA，恢复荧光；
[0062] 上述的荧光生物传感器的应用，应用方法具体为：利用制备的荧光生物传感器，加入不同浓度的碱性磷酸酶荧光恢复强度不同，构建线性关系，实现了基于二维氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台对碱性磷酸酶灵敏性、特异性的检测。
[0063] 在另一个优选实施例中，可以采用如下方案：一种基于二维二氧化锰纳米片构建的荧光传感器包括以下步骤：
[0064] (1)、一步法超声合成单层二维二氧化锰纳米片，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟。
[0065] (2)、将购买的2.5OD FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中，得到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液；
[0066] (3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液，加入不同浓度的二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，得到“关闭”的荧光生物传感器。
[0067] (4)、在步骤(3)中得到的混合液中，加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，得到“开”的荧光生物传感器。
[0068] 具体的，步骤(1)二氧化锰纳米片的制备：取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液，将混合液超声30分钟，形成棕褐色溶液，将超声后的混合液先7000rpm离心15分钟后，用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物，再将沉淀在60℃干燥，最后，将沉淀超声分散在50ml去离子水中。
[0069] 进一步的，步骤(1)中高锰酸钾浓度为10mM，吗啉乙磺酸缓冲溶液为0.1M，pH值为6.0。
[0070] 进一步的，步骤(1)中二氧化锰纳米片分散液的浓度为1mg/ml，在4℃下保存备用；
[0071] 具体的，步骤(2)为：将10μL 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲溶液得到500nM溶液，-4℃下保存备用；将够买的碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12且含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释得到2500U/ml，-4℃下保存备用；
[0072] 进一步的，步骤(2)中稀释FAN-DNA的缓冲溶液Tris-HCl的pH为8.5，浓度为0.1M。
[0073] 具体的，步骤(3)为：取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，室温下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上，FAM的荧光被猝灭，得到“关闭”的荧光生物传感器。
[0074] 进一步的，步骤(3)中FAM-DNA溶液加入二氧化锰纳米片反应不同时间，反应5min FAM荧光能达到最大程度的猝灭。
[0075] 进一步的，步骤(3)中FAM-DNA最终浓度为100nM，二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/mL；
[0076] 进一步的，步骤(3)中的混合液，用荧光仪检测荧光强度。
[0077] 具体的，步骤(4)为：在步骤(3)中得到的混合液中，加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸，还原二氧化锰纳米片，释放出FAM-DNA，恢复荧光，得到“开”的荧光生物传感器。
[0078] 进一步的，步骤(4)中FAM-DNA最终浓度为100nM，二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/Ml，维生素C磷酸酯镁的最终浓度为0.02M，和碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；
[0079] 进一步的，步骤(4)中碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释；
[0080] 进一步的，步骤(4)中的混合液，用荧光仪检测荧光强度，构建线性关系，实现对碱性磷酸酶活性的检测。
[0081] 由于二氧化锰纳米片可以吸附FAM-DNA，猝灭其荧光信号，因此降低背景信号，而维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶反应生成抗坏血酸使二氧化锰纳米片还原成锰离子，释放出FAM-DNA并恢复荧光信号，而FAM-DNA的荧光信号强度与抗坏血酸的浓度相关，也就与碱性磷酸酶的浓度有关。随着碱性磷酸酶浓度的增加，FAM-DNA的荧光信号强度会随之增加，因此，此荧光传感器可对不同浓度的碱性磷酸酶活性检测。
[0082] 优选实施例1
[0083] 一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法，包括以下步骤：
[0084] (1)、配置10mM的高锰酸钾溶液和0.1M，pH＝6.0的吗啉乙磺酸缓冲溶液，用于合成二氧化锰纳米片。
[0085] (2)、将购买的FAM-DNA序列(FAM-DNA:FAM-AAA AAA AAA AAA AAA)溶解在0.1M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液中，并在4℃下保存备用；将购买的碱性磷酸酶溶解在0.01M pH＝8.12且含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液中，并在-4℃下保存备用。
[0086] (3)、将5ml高锰酸钾溶液加入到12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟形成棕褐色溶液，然后将超声后的混合液7000rpm离心15分钟，用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物，再将沉淀在60℃干燥，最后，将沉淀超声分散在50ml去离子水中。
[0087] (4)、取一定量步骤(3)得到的二氧化锰纳米片溶液，加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，得到“关闭”的荧光生物传感器；
[0088] (5)、重复步骤(4)后，再加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸，还原二氧化锰纳米片，释放出FAM-DNA，恢复荧光，得到“开”的荧光生物传感器；
[0089] 一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及应用，具体方法为：
[0090] a、将5ml高锰酸钾溶液加入到12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟形成棕褐色溶液，然后将超声后的混合液7000rpm离心15分钟，用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物，再将沉淀在60℃干燥，最后，将沉淀超声分散在50ml去离子水中；
[0091] 实验中，二氧化锰纳米片通过扫描电子显微镜(图2A)和透射电子显微镜(图2B)表征，证明合成的二氧化锰纳米片是理想的；
[0092] b、在含有100nM的FAM-DNA溶液中分别加入不同浓度的二氧化锰纳米片，浓度分别为0.0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16，0.20，0.30，0.40，and 0.50mg/ml，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，分别测检测荧光强度。
[0093] 实验在含有0.02～0.5mg/mL的二氧化锰时都可以进行，但是从0.20mg/ml时信号衰减缓慢，所以选择0.20mg/ml L二氧化锰纳米片作为实验最优条件。
[0094] c、在100nM的FAM-DNA溶液中，加入0.20mg/ml二氧化锰纳米片，混合均匀，反应5min后，再加入40μL维生素C磷酸酯镁和30μL的碱性磷酸酶，混合均匀，在37℃放置30min，二氧化锰纳米片被还原成锰离子，FAM-DNA成游离态，恢复荧光。证明该实验具有可行性。
[0095] 优选实施例2
[0096] 一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法，包括以下步骤：
[0097] 在含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸，还原二氧化锰纳米片，释放出FAM-DNA，恢复荧光，得到“开”的荧光生物传感器。
[0098] 一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及应用，具体方法为：
[0099] a、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中分别反应5、10、15、20、25、30、35min，检测FAM-DNA的荧光强度。
[0100] 实验体系的荧光信号强度随着反应时间的增加而增加，但经过实验数据的比较，如图4A，实验反应时间超过30min后荧光信号增加不明显，所以选择实验反应时间30min为最优条件。
[0101] b、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，在不同温度的恒温箱中30min，检测FAM-DNA的荧光强度。
[0102] 实验体系分别在20、30、35、40、50、60℃反应30min，如图4B，由荧光恢复强度可知实验的培养温度为37℃时，实验的效果最好。
[0103] c、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，分别使用pH值分别为6，7，7.5，8，8.5，9，10的Tris-HCl缓冲溶液，在37℃的恒温箱中反应30min，检测FAM-DNA的荧光强度。
[0104] 实验体系的环境对实验结果有很大影响，如图4C，所用缓冲溶液的pH值为8.5实验结果最佳。
[0105] d、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再加入不同浓度的维生素C磷酸酯镁和30ul碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，检测FAM-DNA的荧光强度。
[0106] 实验中的维生素C磷酸酯镁浓度可在0.002-0.025M之间，但经过实验数据的比较，如图4D，维生素C磷酸酯镁浓度为0.020M，实验的效果最好。
[0107] e、在含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液，混合均匀，在37℃放置5min，使FAM-DNA荧光衰减，再加入0.02M维生素C磷酸酯镁和不同浓度的碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，检测FAM-DNA的荧光强度。
[0108] 在最优实验条件下，碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；检测荧光恢复强度，构建线性关系，实现对碱性磷酸酶活性的检测。
[0109] 本申请的检测结果与现有技术相比，结果如下：
[0110]碱性磷酸酶检测方法 检测范围 参考文献
本申请 5-500U/L 本申请
比色 5-100mU/mL Gao et.al.(2014)
比色 20–200U/L Yang et.al.(2015)
电化学 1-20U/ml Miao et.al.(2011)
荧光 3.4--100.0U/L Tang et.al.(2016)
荧光 0.1—10U/L Zhang et.al.(2015
荧光 0–30U L1 Li et.al.(2014)
[0111] 上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
