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一种生物适配体传感器的制备方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2016-09-21

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2017-03-22

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2018-08-17

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2036-09-21

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201610836544.0	申请日	2016-09-21
公开/公告号	CN106442673B	公开/公告日	2018-08-17
授权日	2018-08-17	预估到期日	2036-09-21
申请年	2016年	公开/公告年	2018年
缴费截止日
分类号	G01N27/327 、G01N27/416 、B82Y15/00 、B82Y30/00	主分类号	G01N27/327
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	9
权利要求数量	10	非专利引证数量	1
引用专利数量	1	被引证专利数量	0
非专利引证	1、Zhu, Zhang et al..DNA Hybridizationat Magnetic Nanoparticles withElectrochemical Stripping Detection. 《Electroanalysis》.2011,第16卷(第23期),1925–1930. Jie, Wang et al..Versatileelectrochemiluminescence assays forcancer cells based on dendrimer/CdSe-ZnS-quantum dot nanoclusters《.Analyticalchemistry》.2011,第83卷(第10期),3873–3880. Chen, Öçsoy et al..One-step facilesurface engineering of hydrophobicnanocrystals with designer molecularrecognition《.Journal of the AmericanChemical Society》.2012,第134卷(第32期),13164–13167.;
引用专利	CN102686997A	被引证专利
专利权维持	6	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	安徽师范大学	第一申请人	安徽师范大学
专利权人	安徽师范大学	当前专利权人	安徽师范大学
发明人	王广凤、洪璐	第一发明人	王广凤
地址	安徽省芜湖市弋江区花津南路安徽师范大学	邮编	241000
申请人数量	1	发明人数量	2
申请人所在省	安徽省	申请人所在市	安徽省芜湖市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

芜湖安汇知识产权代理有限公司

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

任晨晨

摘要

本发明涉及一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：制备缓冲溶液；合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；制备适配体2修饰电极；加入血小板衍生生长因子‑BB，构建生物传感器。本发明采用应用广泛的便携式血糖仪结合适配体构建生物传感器，旨在为快速、定量通过转换出的葡萄糖含量为间接检测血小板衍生生长因子提供一种新的方法。

摘要附图
说明书附图：abs-1
说明书附图：图1
说明书附图：图2A
说明书附图：图2B
说明书附图：图3A
说明书附图：图3B
说明书附图：图3C
说明书附图：图4
说明书附图：图5A
说明书附图：图5B
说明书附图：图5C
说明书附图：图6

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2018-08-17	授权
2	2017-03-22	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 27/327 专利申请号: 201610836544.0 申请日: 2016.09.21
3	2017-02-22	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备缓冲溶液；
(2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；
(3)合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；
(4)制备适配体2修饰电极；
(5)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器。

2.如权利要求1所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲溶液包括实验体系所用缓冲溶液和/或DNA缓冲溶液。

3.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。

4.如权利要求3所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，DNA序列分别为：
适配体1:CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATC CTGTTTTTT-biotin；适配体2:
CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTT-(CH2)3-HS；底物DNA：biotin–CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAG GAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-(CH2)3-SH；8-17DNA酶：
CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT。

5.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用水热法合成ZnS纳米簇，包括如下步骤：
(2-1)将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液；
(2-2)室温下搅拌30分钟；
(2-3)装入反应釜中140℃加热90分钟；
(2-4)冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质；
(2-5)20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。

6.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中制备适配体1修饰ZnS纳米簇，包括如下步骤：
(2-6)将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中；
(2-7)25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL PBS缓冲溶液中；
(2-8)震荡15分钟；
(2-9)加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇；
(2-10)室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液；
(2-11)适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM；
(2-12)室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。

7.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)合成Fe3O4纳米粒子包括如下步骤：
(3-1)1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液；
(3-2)加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇；
(3-3)混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中；
(3-4)200℃加热8小时；
(3-5)冷却至室温；
(3-6)用乙醇和水清洗；
(3-7)60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

8.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括如下步骤：
(4-1)在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中；
(4-2)室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键；
(4-3)用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM；
(4-4)将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面；
(4-5)在黑暗环境下室温反应2小时；
(4-6)用超纯水清洗；
(4-7)将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM 6-巯基乙醇的20mM PBS以封闭剩余的空穴。

9.如权利要求8所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4-7)中PBS的pH＝7.4。

10.如权利要求1或2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)包括如下步骤：
(5-1)将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中；
(5-2)将电极浸没在200μL含有14μL 1.0mM AgNO3的PBS缓冲溶液中；
(5-3)室温下反应10分钟；
(5-4)在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM 8-17DNA酶在37℃反应60分钟；
(5-5)底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA转换酶；
(5-6)20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中；
(5-7)在室温下反应20分钟。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种生物适配体传感器的制备方法及检测血小板衍生生长因子-BB的方法，可以实现对血小板衍生生长因子-BB的灵敏检测。

背景技术

[0002] 血小板衍生生长因子是血管内皮生长因子家族的一种含有糖链的多肽生长因子，具有较好的热稳定性，耐热度可达100℃，等电点为9.8，其相对分子量为30kD左右。血小板衍生生长因子存在至少三种异构体；血小板衍生生长因子-AA，血小板衍生生长因子-AB和血小板衍生生长因子－BB，其中PDGF-AA和血小板衍生生长因子为同型二聚体，PDGF-AB为异型二聚体。血小板衍生生长因子无论是在正常生理还是病理状态下都起着重要的作用。在正常生理状态下，血小板衍生生长因子能够促进多种间质细胞(如肾小球血管细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等)的趋化、分裂和增殖，并且对机体的生长发育有着重要的作用。但是，血小板衍生生长因子的异常表达及其受体的过度激活可诱导形成肿瘤新生血管而直接或间接地促进肿瘤细胞的增殖与迁移。其中，血小板衍生生长因子-BB与肿瘤细胞的生长与转化有直接的关系，在肿癌细胞中会过度表达。因此，它是一种重要的肿瘤标记物，对于癌症的诊断、治疗及预后有着重要的意义，检测血小板衍生生长因子-BB具有重要的科研价值。

[0003] 近年来由于核酸适配体的发展及其相对于抗体的诸多优势，采用适配体为识别原件的生物传感器检测蛋白质得到了广泛的应用。核酸适配体是通过一种体外筛选技术—指数富集配体系统进化技术筛选出来的一种能与蛋白质和小分子物质特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸片段，一般由25-80个碱基组成。适配体具有高特异性和亲和力，且目标分子范围广，不仅可与大分子(如核酸、蛋白质、多肽等)结合，也能与小分子(如氨基酸、金属离子等)结合，甚至还可与整个细胞结合。这就表明适配体为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。适配体比抗体更容易修饰，而且可以在适配体的精确位点进行修饰，并且不影响其亲和力，如修饰一些电化学探针、荧光基团和猝灭基团等，这就使得生物传感器的构建更加方便。近年来，随着对核酸适配体的进一步了解，基于适配体的生物传感器的发展及应用得到了广泛地关注，并且构建了一系列基于适配体的生物传感器用于蛋白质的检测、小分子的检测、药物分析、环境监测，食品检测等领域。

[0004] 生物传感技术的发展与进步大大的推动了电分析化学在生物化学领域中的应用。然而电化学方法仪器较为笨重，因而应用一种便携式的检测设备成为分析化学新的发展方展。血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器。由于其体积小、成本低、操作简单，能够得到准确的定量结果，在生活中已经得到了广泛应用，改善了糖尿病患者的生活质量。然而，血糖仪只能检测葡萄糖这一种物质，并且检测范围是0.6～33mmol/L(10～600mg/dL)。目前利用血糖仪结合抗体或DNA定量检测非葡萄糖物质的方法已有报道，如运用血糖仪结合功能性DNA传感器定量检测多种目标分子，使用商业化的个人血糖仪便携式定量DNA分子，采用侵入式DNA方法结合血糖仪便携式定量检测金属离子。在实际检测中，目标物往往含量极低，而采用常规的生物传感技术来检测这些浓度极低的物质时，很难达到检测的目的。

发明内容

[0005] 针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种生物适配体传感器的制备方法，以DNA可组装、可折叠性质为基础，使用血糖仪作为检测仪器快速便捷的检测目标物质，利用阳离子交换释放出Zn2+进行DNA酶剪切循环从而进行信号放大提高实验的灵敏度，构建信号放大的适配体生物传感器，构建灵敏、快速的检测血小板衍生生长因子-BB方法。

[0006] 一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)制备缓冲溶液；

[0008] (2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；

[0009] (3)合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；

[0010] (4)制备适配体2修饰电极；

[0011] (5)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器。

[0012] 进一步地，步骤(1)中所述缓冲溶液包括实验体系所用缓冲溶液和/或DNA缓冲溶液。

[0013] 进一步地，步骤(1)包括以下步骤：将分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。

[0014] 进一步地，DNA序列分别为：

[0015]

[0016]

[0017] 进一步地，步骤(2)中采用水热法合成ZnS纳米簇，包括如下步骤：

[0018] (2-1)将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液；

[0019] (2-2)室温下搅拌30分钟；

[0020] (2-3)装入反应釜中140℃加热90分钟；

[0021] (2-4)冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质；

[0022] (2-5)20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。

[0023] 进一步地，步骤(2)中制备适配体1修饰ZnS纳米簇，包括如下步骤：

[0024] (2-6)将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中；

[0025] (2-7)25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL PBS缓冲溶液中；

[0026] (2-8)震荡15分钟；

[0027] (2-9)加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇；

[0028] (2-10)室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液；

[0029] (2-11)适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM；

[0030] (2-12)室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。

[0031] 进一步地，步骤(3)合成Fe3O4纳米粒子包括如下步骤：

[0032] (3-1)1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液；

[0033] (3-2)加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇；

[0034] (3-3)混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中；

[0035] (3-4)200℃加热8小时；

[0036] (3-5)冷却至室温；

[0037] (3-6)用乙醇和水清洗；

[0038] (3-7)60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

[0039] 进一步地，步骤(4)包括如下步骤：

[0040] (4-1)在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中；

[0041] (4-2)室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键；

[0042] (4-3)用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM；

[0043] (4-4)将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面；

[0044] (4-5)在黑暗环境下室温反应2小时；

[0045] (4-6)用超纯水清洗；

[0046] (4-7)将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM 6-巯基乙醇的20mM PBS以封闭剩余的空穴。

[0047] 进一步地，步骤(4-7)中PBS的pH＝7.4。

[0048] 进一步地，步骤(5)包括如下步骤：

[0049] (5-1)将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中；

[0050] (5-2)将电极浸没在200μL含有14μL 1.0mM AgNO3的PBS缓冲溶液中；

[0051] (5-3)室温下反应10分钟；

[0052] (5-4)在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM 8-17DNAzyme在37℃反应60分钟；

[0053] (5-5)底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶；

[0054] (5-6)20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中；

[0055] (5-7)在室温下反应20分钟。

[0056] 与目前现有技术相比，本发明采用应用广泛的便携式血糖仪结合适配体构建生物传感器，旨在为快速、定量通过转换出的葡萄糖含量为间接检测血小板衍生生长因子提供一种新的方法，构建一些具有高灵敏度、信号放大型的电化学生物传感器已经成为人们日益研究的重心。其中，最有效且最常用的方法就是通过某种信号放大策略来使检测信号使信号得到增强，从而提高分析的灵敏度。

实施方案

[0068] 下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

[0069] 在一个优选实施例中，一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0070] (1)制备实验体系所用缓冲溶液以及DNA缓冲溶液；

[0071] (2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；

[0072] (3)制备适配体2修饰电极；

[0073] (4)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器并检测。

[0074] 步骤(1)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。DNA序列分别为：

[0075]

[0076] 步骤(2)包括以下步骤：水热法合成ZnS纳米簇。将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液，室温下搅拌30分钟。接着，装入反应釜中，140℃加热90分钟。冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质，20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。合成Fe3O4纳米粒子。1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液，再加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇，混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中，200℃加热8小时，冷却至室温，用乙醇和水清洗多次，60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

[0077] 将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中。25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL PBS缓冲溶液中，震荡15分钟后，加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇，室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液。适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM，室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。同样步骤制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子。

[0078] 步骤(3)包括以下步骤：在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM，将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的20mM PBS(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。

[0079] 所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

[0080] 步骤(4)为：将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中，由于适配体-目标物-适配体的作用，血小板衍生生长因子-BB识别步骤(3)的适配体2连接到电极上，接着，步骤(2)得到的适配体1修饰ZnS纳米簇识别血小板衍生生长因子-BB进一步连接到电极上，得到适配体1/血小板衍生生长因子-BB/适配体2修饰电极。接着，将电极浸没在200μL含有14μL 1.0mM AgNO3的PBS缓冲溶液中，室温下反应10分钟。接着，在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM 8-17DNAzyme在37℃反应60分钟。接着，底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶。最后，20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中，在室温下反应20分钟，从此溶液中取2μL滴加到血糖仪试纸上进行检测。

[0081] 在另一个优选实施例中，为了更高效灵敏便捷地检测目标物质血小板衍生生长因子的浓度和含量，在本实验中我们拟以DNA可组装、可折叠性质为基础，使用血糖仪作为检测仪器快速便捷的检测目标物质，利用阳离子交换释放出Zn2+进行DNA酶剪切循环从而进行信号放大提高实验的灵敏度，构建信号放大的适配体生物传感器，构建灵敏、快速的检测血小板衍生生长因子-BB方法。提供的一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0082] (1)制备实验体系所用缓冲溶液以及DNA缓冲溶液；

[0083] (2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；

[0084] (3)制备适配体2修饰电极；

[0085] (4)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器并检测。

[0086] 步骤(1)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。DNA序列分别为：

[0087]

[0088] 步骤(2)包括以下步骤：水热法合成ZnS纳米簇。将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液，室温下搅拌30分钟。接着，装入反应釜中，140℃加热90分钟。冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质，20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。合成Fe3O4纳米粒子。1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液，再加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇，混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中，200℃加热8小时，冷却至室温，用乙醇和水清洗多次，60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

[0089] 将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中。25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL PBS缓冲溶液中，震荡15分钟后，加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇，室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液。适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM，室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。同样步骤制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子。

[0090] 步骤(3)包括以下步骤：在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM，将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的20mM PBS(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。

[0091] 所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

[0092] 步骤(4)为：将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中，由于适配体-目标物-适配体的作用，血小板衍生生长因子-BB识别步骤(3)的适配体2连接到电极上，接着，步骤(2)得到的适配体1修饰ZnS纳米簇识别血小板衍生生长因子-BB进一步连接到电极上，得到适配体1/血小板衍生生长因子-BB/适配体2修饰电极。接着，将电极浸没在200μL含有14μL1.0mMAgNO3的PBS缓冲溶液中，室温下反应10分钟。接着，在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM 8-17DNAzyme在37℃反应60分钟。接着，底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶。最后，20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中，在室温下反应20分钟，从此溶液中取2μL滴加到血糖仪试纸上进行检测。

[0093] 优选实施例1

[0094] 一种基于DNA酶三重放大利用血糖仪便携检测血小板衍生生长因子-BB的方法，包括以下步骤：

[0095] 步骤(1)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝5～10PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。DNA序列分别为：

[0096]

[0097] 步骤(2)包括以下步骤：水热法合成ZnS纳米簇。将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液，室温下搅拌30分钟。接着，装入反应釜中，140℃加热90分钟。冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质，20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。合成Fe3O4纳米粒子。1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液，再加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇，混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中，200℃加热8小时，冷却至室温，用乙醇和水清洗多次，60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

[0098] 将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的pH＝5～10PBS缓冲溶液中。25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL pH＝5～10PBS缓冲溶液中，震荡15分钟后，加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇，室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液。适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM，室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。同样步骤制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子。

[0099] 步骤(3)包括以下步骤：在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM，将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM 6-巯基乙醇的20mM PBS(pH＝5～10)以封闭剩余的空穴。

[0100] 所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

[0101] 步骤(4)为：将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中，由于适配体-目标物-适配体的作用，血小板衍生生长因子-BB识别步骤(3)的适配体2连接到电极上，接着，步骤(2)得到的适配体1修饰ZnS纳米簇识别血小板衍生生长因子-BB进一步连接到电极上，得到适配体1/血小板衍生生长因子-BB/适配体2修饰电极。接着，将电极浸没在200μL含有14μL1.0mMAgNO3的pH＝5～10PBS缓冲溶液中，室温下反应10分钟。接着，在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM 8-17DNAzyme在37℃反应60分钟。接着，底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶。最后，20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中，在室温下反应20分钟，从此溶液中取2μL滴加到血糖仪试纸上进行检测。

[0102] 优选实施例2

[0103] 步骤(1)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mM pH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。DNA序列分别为：

[0104]

[0105]

[0106] 步骤(2)包括以下步骤：水热法合成ZnS纳米簇。将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液，室温下搅拌30分钟。接着，装入反应釜中，140℃加热90分钟。冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质，20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。合成Fe3O4纳米粒子。1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液，再加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇，混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中，200℃加热8小时，冷却至室温，用乙醇和水清洗多次，60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。

[0107] 将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中。25μL 1mg/mL的链霉亲和素6mg of 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mL PBS缓冲溶液中，震荡15分钟后，加入20μL 1mg/mL的ZnS纳米簇，室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液。适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM，室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。同样步骤制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子。

[0108] 步骤(3)包括以下步骤：在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM，将5μL 0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的20mM PBS(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。

[0109] 所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

[0110] 步骤(4)为：将几支电极分别浸入到几个不同浓度的血小板衍生生长因子-BB溶液中，浓度依次为1.0×10-15M,3.16×10-15M,1.0×10-14M,3.16×10-14M,1.0×10-13M,3.16×10-13M,1.0×10-12M,3.16×10-12M。由于适配体-目标物-适配体的作用，血小板衍生生长因子-BB识别步骤(3)的适配体2连接到电极上，接着，步骤(2)得到的适配体1修饰ZnS纳米簇识别血小板衍生生长因子-BB进一步连接到电极上，得到适配体1/血小板衍生生长因子-BB/适配体2修饰电极。接着，将电极浸没在200μL含有14μL1.0mMAgNO3的PBS缓冲溶液中，室温下反应10分钟。接着，在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM8-17DNAzyme在37℃反应60分钟。接着，底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶。最后，20μL 1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中，在室温下反应20分钟，从此溶液中取2μL滴加到血糖仪试纸上进行检测。

[0111] 上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

附图说明

[0057] 图1为基于DNA酶三重放大利用血糖仪便携检测血小板衍生生长因子-BB示意图；

[0058] 图2A为ZnS纳米簇的透射电子显微镜表征；

[0059] 图2B为ZnS纳米簇修饰适配体1的透射电子显微镜表征；

[0060] 图3A为Fe3O4纳米粒子的扫描电子显微镜表征；

[0061] 图3B为链霉亲和素修饰的Fe3O4纳米粒子的扫描电子显微镜表征；

[0062] 图3C为底物DNA修饰的Fe3O4纳米粒子的扫描电子显微镜表征；

[0063] 图4为实验可行性图。(a)无目标物(b)加入目标物；

[0064] 图5A为适配体和血小板衍生生长因子-BB之间反应时间的实验条件优化图；

[0065] 图5B为转换酶和蔗糖反应时间的实验条件优化图；

[0066] 图5C为实验pH的实验条件优化图；

[0067] 图6为检测不同浓度的血小板衍生生长因子-BB的血糖仪信号；浓度从a到f依次为1.0×10-15M,3.16×10-15M,1.0×10-14M,3.16×10-14M,1.0×10-13M,3.16×10-13M,
1.0×10-12M,3.16×10-12M；

1一种生物适配体传感器的制备方法 2一种表面等离激元共振生物传感器 3荧光生物传感器，其制备方法及其用途 4一种DNA生物传感器及其制备方法和应用 5一种微生物生化需氧量的测定传感器制备方法 6一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 7一种荧光生物传感器，其制备方法以及用途 8一种电化学生物传感器，及其制备方法和用途 9一种超亲水的场效应管生物传感器及其制备方法 10一种适配体电化学生物传感器，其制备方法以及用途