[0030] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0031] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0032] <实施例1>
[0033] 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，包括：
[0034] 步骤一、电极修饰：a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
[0035] b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
[0036] c、将反应液滴加到步骤b中的金电极表面，置于55℃环境中125min后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干，其中，反应液为10mM Tris-HCl，反应液中还含有0.1M的NaCl、1.0mM的MgCl2，0.05U的双链特异性核酸酶；
[0037] d、将步骤c中的金电极表面浸泡于羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液中，于80℃下静置6h，再用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，再用氮气吹干；
[0038] 其中，羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液的制备方法为：将二茂铁和二苯丙氨酸溶于乙醇，使二茂铁和二苯丙氨酸的浓度分别为2mM和1mM，再加入羧基化氧化石墨烯，于超声频率为100KHz超声处理50min，加入颗粒粒径小于25μm的二氧化硅，继续于超声频率为100KHz超声处理30min，过滤取滤液，将滤液置于25℃条件下挥发去除溶剂，得到羧基化氧化石墨烯复合物，将羧基化氧化石墨烯复合物置于超纯水中，于超声频率为100KHz超声处理10min，得到羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液；
[0039] e、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤d中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，再用超纯水冲洗干净，然后用氮气吹干，得到修饰电极；
[0040] 步骤二、重复步骤一制备多个修饰电极，其中，制备多个修饰电极的反应液中还含有miRNA-21溶液，且miRNA-21溶液的miRNA-21的浓度不同；
[0041] 步骤三、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤二制备的修饰电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；
[0042] 步骤四、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液阻抗值的差值与浓度的线性关系；
[0043] 步骤五、按照步骤一制备一个修饰电极，其中，制备该修饰电极中的反应液中加入有10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液；
[0044] 步骤六、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤五中的修饰电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤五中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。
[0045] miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。
[0046] 步骤二中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、2×10-11mol/L，向反应液中加入的miRNA-21溶液的体积为10μL，反应液的总体积为20μL。
[0047] 步骤三和步骤六中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)64-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)64-的总浓度为5mmol。
[0048] 羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。
[0049] miRNA-21适配体溶液是以TE缓冲液为溶剂，TE缓冲液为10mM Tris–HCl，包含1mM EDTA，PH为7.4。
[0050] <实施例2>
[0051] 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法同实施例1，其中，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：
[0052] 将金电极置于NaHCO3浓度为5μM、KCl浓度为10μM的超纯水溶液中，于温度为65℃水浴条件下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，于温度为80℃水浴条件下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。
[0053] <对比例1>
[0054] 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法同实施例1，其中，不同的是，步骤d中的羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液，用羧基化氧化石墨烯饱和溶液代替，羧基化氧化石墨烯饱和溶液的制备方法具体为：将羧基化氧化石墨烯加入超纯水中，于超声频率为100KHz超声处理50min，得到羧基化氧化石墨烯饱和溶液。
[0055] <金电极电化学信号试验>
[0056] 1、如图1所示，为裸金电极，及按实施例1中的步骤a、b、c、d、e制备的5个金电极，一共6个金电极，采用交流阻抗法扫描得到对应的多个交流阻抗曲线图，分别一一对应图1中的a、b、c、d、e、f 6条交流阻抗曲线；
[0057] 由图1可以看出，比较e曲线和a曲线，说明经过步骤a至d的修饰后，可以显著将miRNA-21适配体和羧基化氧化石墨烯复合物修饰到金电极表面，并显著增大电化学信号；
[0058] 比较e曲线和f曲线，说明经过步骤a至e的修饰后，可以将电化信号放大到合适值。
[0059] 如图2所示，为上述6个金电极的计时库伦图；
[0060] 如图3所示，图3是图2中的μC对Time1/2作图。
[0061] 如图2所示，比较e曲线和a曲线，可知经过步骤a至d的修饰后，金电极具有更好的电化学响应，电流强度和表面积较大；比较e曲线和f曲线，说明经过步骤a至e的修饰后，可以进一步增强电流强度和表面积。
[0062] 2、采用实施例1和对比例1的方法检测得到的miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系的R2分别为0.9999和0.9843，说明实施例1的方法中修饰电极所引起的电化学信号更加稳定，可以提高检测的准确性。
[0063] 3、检测混合样品
[0064] 将肺腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞分别加入超纯水，并粉碎，离心，取上清液，即得到4种干扰液；
[0065] 配置4组miRNA-21溶液，每组有4个，且miRNA-21的浓度不同，向每组miRNA-21溶液中加入其中一种干扰液，使干扰液浓度为5×10-11mol/L，miRNA-21的浓度分别为1×10-14 -13 -12 -11
mol/L、1×10 mol/L、1×10 mol/L、1×10 mol/L，得到16个待测样液；
[0066] 采用实施例1的方法分别检测上述16个待测样液，检测得到的miRNA-21的浓度如表1所示，单位是mol/L：
[0067] 表1
[0068]
[0069]
[0070] 由表1可以知道，对于存在干扰液的情况下，实施例1的方法的检测准确性依然可以得保证，具有超强的抗干扰能力，可以准确检测低至到1×10-13mol/L的浓度。
[0071] 采用对比例1的方法分别检测上述16个待测样液，检测得到的miRNA-21的浓度如表2所示，单位是mol/L：
[0072] 表2
[0073] 组别 1×10-14 1×10-13 1×10-12 1×10-11肺腺癌细胞 - - 0.74×10-12 0.90×10-11
胶质母细胞瘤细胞 - - 0.83×10-12 0.92×10-11
乳腺癌细胞 - - 0.85×10-12 0.80×10-11
宫颈癌细胞 - - 0.72×10-12 0.88×10-11
[0074] 由表1与表2的数据比较可知，未采用羧基化氧化石墨烯复合物修饰电极检测，其能准确检测到的最低限为1×10-12并且准确性还不如表1，说明羧基化氧化石墨烯复合物可以增强电化学信号，并且电化学信号更加稳定。
[0075] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
