实施方案
[0023] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0024] 实施例：
[0025] 一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：路氏双髻鲨软骨→组织破碎→盐酸胍抽提→丙酮分级沉淀→凝胶过滤层析纯化→细胞膜色谱纯化→高效液相色谱纯化→血管生成抑制因子。
[0026] 1）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨（Sphyrna lewini）软骨按固液比1 g：10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提36 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4℃以下透析24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心25 min，取上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置1 h后，4 ℃以下、10 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为1 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分[0027] 2）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9～10），得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1.8%加入碱性蛋白酶
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（酶活力≥2.0×10 U/g），酶解温度为50 ℃，酶解5 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持12 min后，10 000g离心25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物；
[0028] 3）路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子。
[0029] ①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7.0磷酸盐缓冲液配成25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强组分为凝胶层析酶解物Fr.C（图1）。
[0030] ②细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr.C用三蒸水配成50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化（条件：进样量50 μL；人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞膜柱（150 mm × 4.6mm，5 μm）；柱温为37 ℃；流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm；流速：0.2 mL/min），其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr.C-II（图2）。
[0031] ③RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物Fr.C-II用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量15 μL；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm），根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用得1个高活性多肽。
[0032] ④结构检测：收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强的多肽，经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK），ESI-MS检测分子量为796.90 Da。
[0033] 将制得的Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK）进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术－无气室孵育法”（记载于《中山大学学报（自然科学版）》，2003年第2册（第42卷）： 第126-128页）。结果表明，路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成并呈剂量依赖关系（表1）。
[0034] 表1 路氏双髻鲨血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用[0035]
[0036] 将制得的PDYKFK进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月英、贾青等“蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研究”（记载于《中国中药杂志》，2011年第12期（第36卷）：第1644-1649页）。给荷Lewis 肺癌小鼠腹腔注射路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK (20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查，检测结果表明：路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK对血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和血小板衍生生长因子(PDGF) 等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表2) 。
[0037] 表2 路氏双髻鲨血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用
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[0039] 尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
