一种杂色曲霉Av-2菌株及其应用   0    0

[0001] 本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产洛伐他汀的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)Av-2菌株、用途和发酵生产方法。

[0002] 杂色曲霉(Aspergillus versicolor)是世界性广泛分布种，也是我国最常见的曲霉之一。杂色曲霉作为曲霉属的一种，能产生多种有用的活性代谢产物，分别具有抗菌、抗虫、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化，抗炎症、细胞免疫等多种生物活性。文献(罗寒,李晓栋,李晓明,等.红树林来源内生真菌杂色曲霉Aspergillus versicolor MA-229次级代谢产物研究.中国抗生素杂志,2017,42(4):S14-S20.)从分离自红树林植物内生真菌的杂色曲霉MA-229的发酵产物中分离得到9个化合物，分别对小麦全蚀病菌和小麦赤霉病菌有较好的抑制活性，并且还有抗虫活性；文献(Yan M X,Mao W J,Liu X,et al.Extracellular Polysaccharide with Novel Structure and Antioxidant Property Produced by the Deep-sea Fungus Aspergillus versicolor N(2)bC.Carbohydrate Polymers,2016,147:
272-281.)从深海中分离到1株杂色曲霉，可产生具有抗氧化活性的胞外多糖体；文献(巩婷,董世豪,朱平,等.海洋真菌杂色曲霉F62丁内酯类化合物研究.菌物学报,2014,33(3):
706-712.)从海洋真菌杂色曲霉F62中分离得到6个丁内酯类活性化合物，均表现出较强的抗炎活性。大量文献表明杂色曲霉(A.versicolor)生物活性物质非常丰富。

[0003] 1980年，Alberts等从土曲霉(A.terreus)中提取到称为洛伐他汀(洛伐他汀)的化合物。洛伐他汀是降血脂的他汀类药物，可用于治疗心血管疾病；目前，洛伐他汀在食品和药品工业中已被广泛应用；因此，选育稳定高产洛伐他汀的曲霉菌株对并其发酵工艺条件进行优化，具有较好的现实意义和应用前景。

[0004] 针对市场上洛伐他汀需求日益增长，生产洛伐他汀优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的第一个目的是提供1株高产洛伐他汀杂色曲霉Av-2菌株，本发明的第二个目的是发酵生产的方法。

[0005] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

[0006] 本发明所述杂色曲霉(Aspergillus versicolor)Av-2菌株，保藏编号为：CCTCC M 2016379，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。

[0007] 从各地不同生境收集的自然发酵样品中分离纯化获186株曲霉纯菌株；经薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中洛伐他汀含量筛选(附图1，附图2，附图3)，获1株高产洛伐他汀的编号为Av-2曲霉菌株，该菌株分离自番茄表面；根据形态特征和ITS基因序列，鉴定Av-2曲霉菌株为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)；Av-2曲霉菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2016379，保藏日期为：2016年7月7日。

[0008] Av-2曲霉菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状或絮状，后变成灰绿色，边缘白色，15d菌落直径达50mm(附图4)；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，分支状；分生孢子头初为球形，后呈放射形(附图5，图6)，顶囊呈半椭圆形至半球形；上半部或3/4部位着生小梗，小梗双层(附图6)，分生孢子呈淡绿色，球形或近球形，粗糙，直径4～5μm×4～4.5μm(附图7)。

[0009] rDNA ITS基因：序列分析结果表明，ITS基因长度为545bp(附图8)，与杂色曲霉(Aspergillus versicolor)亲关系最接近，达99％(附图9)。根据Av-2曲霉菌株的形态特征和rDNA ITS基因序列，结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表，鉴定Av-2菌株为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。

[0010] Av-2曲霉菌株具有高产洛伐他汀、培养简单等特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，Av-2曲霉菌株通过液体发酵培养和发酵条件优化后，发酵培养80h～100h，洛伐他汀产量可达154μg/mL～158μg/mL(附图10)。用远藤章教授方法提取发酵液中的洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品相一致。Av-2曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。

[0011] 本发明的杂色曲霉(A.versicolor)Av-2菌株可用于发酵生产洛伐他汀。

[0012] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

[0013] 一种高产洛伐他汀的生产方法，该方法包括以下的步骤：

[0014] 1)用接种针挑少量所述的菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；

[0015] 2)取平皿中1菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；

[0016] 3)在二级种子培养液中，按6％加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；

[0017] 4)在5L发酵罐发酵培养液中按20％接入二级种子进行发酵培养；发酵时间为80h～100h；

[0018] 5)过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中洛伐他汀，与滤液混合；提取洛伐他汀，蒸干后得块状晶体。

[0019] 作为优选，按重量百分比，PDA培养基包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L，pH 5.5～6.0；一级种子培养液包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、KH2PO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.1％、pH 5.5～6.0；二级种子培养液包括：乳糖10％、甘油1％、蛋白胨0.5％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、NaNO3 0.1％、pH 5.5～6.0；发酵培养液包括：
乳糖18％、甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、MgSO4·7H2O 0.1％，NaNO3 0.2％、KH2PO4 
0.1％、ZnSO4 0.2％、pH 5.5～6.0。

[0020] 本发明取发酵液10mL，加甲醇40mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测洛伐他汀产量，可达154μg/mL～158μg/mL(附图10)。

[0021] Av-2曲霉菌株5L发酵罐发酵80h～100h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中洛伐他汀，与滤液混合；用远藤章教授方法提取洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明发酵液中洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品一致。

[0022] 本发明所筛选的杂色曲霉(A.versicolor)Av-2菌株，具有高产洛伐他汀、培养简单等特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，Av-2曲霉菌株通过液体发酵培养和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵培养80h～100h，洛伐他汀产量可达154μg/mL～158μg/mL(附图10)。用远藤章教授方法提取发酵液中的洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品相一致。有关杂色曲霉(A.versicolor)产生洛伐他汀还未见有报道，所筛选的Av-2菌株是较有潜力的工业菌株。

[0033] 下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

[0034] 实施例1杂色曲霉(Aspergillus versicolor)Av-2菌株的筛选和鉴定

[0035] 1培养基

[0036] ①PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂粉2.0％，水1L，pH 5.5～6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。

[0037] ②PD培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L，pH 5.5～6.0。

[0038] 用于高产洛伐他汀曲霉菌株的筛选。

[0039] 2实验方法

[0040] 2.1曲霉菌株的分离纯化

[0041] 从不同生境收集的自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，26℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25％甘油中，置于4℃冰箱备用。

[0042] 2.2高产洛伐他汀曲霉菌株的筛选

[0043] 曲霉各保存菌株26℃PDA平板培养3d后，用打孔器取1菌饼(直径0.8mm)转接种于PD培养液中，26℃、200r/min摇床培养7d得发酵液。

[0044] (1)薄层层析法(TLC)初筛：发酵液超声破壁30min，取1.5mL于离心管中，8000rpm离心10min，取上清液500μL加100μL乙酸乙酯振荡萃取取上层液为待测样品，毛细吸管吸取1/4管样品点5次于硅胶板上；洛伐他汀标准品作对照，乙酸乙酯作展开剂，展开后晾干，
254nm波长紫外灯观察斑点并拍照。

[0045] (2)高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中洛伐他汀含量复筛：取发酵液0.4mL于洁净的2mL离心管，再加入1.6mL的纯甲醇，25Hz超声波30min，50℃水浴2h，间歇振荡3～4次，8000rpm，离心10min，吸取上清液用0.45nm的有机膜过滤到另一洁净的2mL离心管中，HPLC法检测发酵滤液。

[0046] HPLC检测的色谱条件：Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm液相色谱柱；乙腈为色谱纯(德国Fisher Scientific公司)，磷酸为优级纯，水为超纯水，检测波长λ＝237nm，柱温28℃，流速1mL/min，进样量20μL。

[0047] (3)洛伐他汀标准曲线的绘制

[0048] ①1000μg/mL洛伐他汀标准溶液配制：精准称取洛伐他汀标准品0.0050g置于50mL容量瓶，加无水乙醇40mL，振荡溶解，定容至50mL，制成浓度为1000μg/mL标准品。

[0049] ②取6个1.5mL离心管，分别用移液枪吸取1μL、5μL、10μL、25μL、50μL、100μL的洛伐他汀标准液于离心管中，再加入无水乙醇定容到1.5mL。

[0050] ③HPLC法测定，每管洛伐他汀标准液重复测定3次，以洛伐他汀浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制洛伐他汀标准曲线(附图1)。

[0051] 2.3 Av-2菌株的鉴定

[0052] Av-2菌株PDA培养基平板上26℃培养7d，显微镜观察Av-2菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征。

[0053] 提取Av-2菌株的基因组DNA，扩增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司测序。根据形态特征和rDNA ITS基因序列，参考曲霉属《The Genus Aspergillus》分种检索表，确定分类地位。

[0054] 3实验结果

[0055] 3.1产洛伐他汀曲霉菌株的薄层层析法(TLC)初筛结果

[0056] 通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)中共获得186株曲霉纯菌株。通过薄层层析法初步筛选得到30株产洛伐他汀的曲霉菌株(附图2)。如图所示，有些曲霉菌株发酵液能看到与标准品条带相同位置明显的条带，表明该菌株产洛伐他汀含量较高；有些菌株在该位置条带不明显，表明该菌株产洛伐他汀能力较弱；也有很多菌株在该位置没有出现条带，表明该菌株不产洛伐他汀。挑取薄层层析目的条带较明显的菌株进行HPLC法定量检测复筛。

[0057] 3.2曲霉属菌株洛伐他汀产量高效液相法(HPLC)检测复筛结果

[0058] 用HPLC法对30株产洛伐他汀的曲霉纯菌株发酵液进行复筛(附图3)，结果表明不同30株曲霉菌株洛伐他汀产量存在显著差异。经筛选编号为Av-2的曲霉菌株洛伐他汀产量最高，为88μg/mL。该菌株分离自番茄表面。Av-2菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2016379，保藏日期为：2016年7月7日。下面将对Av-2曲霉菌株进行形态特征描述和鉴定。

[0059] 3.3 Av-2曲霉菌株的鉴定结果

[0060] Av-2曲霉菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状或絮状，后变成灰绿色，边缘白色，7d菌落直径达50mm(附图4)；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，分支状；分生孢子头初为球形，后呈放射形(附图5，图6)，顶囊呈半椭圆形至半球形；上半部或3/4部位着生小梗，小梗双层(附图6)，分生孢子呈淡绿色，球形或近球形，粗糙，直径4～5μm×4～4.5μm(附图7)。

[0061] rDNA ITS基因序列：分析结果表明，ITS基因长度为545bp(附图8)，与杂色曲霉(Aspergillus versicolor)亲关系最近，达99％(附图9)。根据Av-2曲霉菌株的形态特征和rDNA ITS基因序列，结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表，鉴定Av-2菌株为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。

[0062] 实施例2 Av-2曲霉菌株在5L发酵罐中洛伐他汀的产生、制备及鉴定

[0063] 1菌株：Av-2曲霉菌株。

[0064] 2培养基

[0065] ①PDA培养基：配方同实施例1。

[0066] ②一级种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、KH2PO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.1％、pH 5.5～6.0。

[0067] ③二级种子培养液：乳糖10％、甘油1％、蛋白胨0.5％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、NaNO3 0.1％、pH 5.5～6.0。

[0068] ④发酵培养液：乳糖18％、甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、MgSO4·7H2O 0.1％，NaNO3 0.2％、KH2PO4 0.1％、ZnSO4 0.2％、pH 5.5～6.0。

[0069] 3实验方法

[0070] 3.1 Av-2曲霉菌株的培养

[0071] 用接种针挑少量Av-2曲霉菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取平皿中1菌饼(直径0.8mm)接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；在二级种子培养液中，按6％加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；在5L发酵罐发酵培养液中按20％接入二级种子进行发酵培养。

[0072] 发酵培养条件：26℃、pH 5.5、转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa～0.5MPa。

[0073] 3.2洛伐他汀产量随发酵时间变化曲线分析

[0074] 每隔4h取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测洛伐他汀产量，以培养时间为横坐标，洛伐他汀产量为纵坐标，绘制Av-2曲霉菌株洛伐他汀产量随发酵时间变化曲线。

[0075] 3.3发酵液中洛伐他汀的分离纯化和鉴定

[0076] Av-2曲霉菌株5L发酵罐发酵80h～100h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中洛伐他汀成分，与滤液混合；用远藤章教授方法分离纯化洛伐他汀，蒸干后得晶体；将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中，核磁共振波谱技术分析鉴定。

[0077] 4实验结果

[0078] 4.1发酵液中洛伐他汀产量随发酵时间的变化

[0079] 每隔4h取样用HPLC法测定Av-2菌株发酵液洛伐他汀产量，洛伐他汀产量随发酵时间的变化曲线见附图10，发酵至80h～100h，发酵液中洛伐他汀产量基本稳定，最大值为158μg/mL。

[0080] 4.2发酵液中洛伐他汀提取物及其鉴定

[0081] 用远藤章教授方法提取洛伐他汀，得到微块状晶体；用核磁共振波谱技术对洛伐他汀标准品和发酵液中洛伐他汀提取物进行分析比对，结果表明发酵液中洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品一致。

[0023] 图1 Lovastatin标准曲线。

[0024] 图2产Lovastatin部分曲霉菌株发酵液薄层层析的结果。

[0025] 图3 Lovastatin标准品和曲霉菌株发酵液HPLC检测图。

[0026] 图4 Av-2曲霉菌株PDA培养基上培养7d菌落正面。

[0027] 图5 Av-2曲霉菌株PDA培养基上培养7d分生孢子头的显微特征(100X)。

[0028] 图6 Av-2曲霉菌株分生孢子头显微特征(400X)。

[0029] 图7 Av-2曲霉菌株分生孢子显微特征(400X)。

[0030] 图8 Av-2菌株ITS rDNA基因序列(545bp)。

[0031] 图9基于12株曲霉属(Aspergillus)ITS rDNA基因序列建立的Av-2菌株系统发育树。

[0032] 图10 Av-2曲霉菌株在5L发酵罐中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。