[0019] 下面对本发明具体实施方式做一个详细说明。
[0020] 实施例1:PigE基因敲除载体的构建:基于同源重组的PigE基因敲除原理如图1所示。
[0021] (1)PigE基因上下游臂和hph基因的扩增:利用GeneBank中公布的红色红曲霉(Monascus ruber)中PigE基因序列(登录号:KF285431.1),设计两对引物P1、P2和P3、P4分别扩增靶基因PigE基因的翻译起始区和终止密码子区侧翼序列,引物序列如表1所示,实验结果如图2所示。PigE基因5’侧翼序列和3’侧翼序列PCR扩增体系如表2所示。PigE基因5’侧翼序列PCR反应条件如下:98℃预变性4min,98℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸1min,循环数为30个,72℃终延伸10min,12℃保存。PigE基因3’侧翼序列PCR反应条件如下:98℃预变性4min,98℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸1min,循环数为30个,72℃终延伸10min,12℃保存。
[0022] 表1敲除载体构建中设计的引物
[0023]
[0024] 注:P1和P2用于扩增PigE基因上游臂,P3和P4用于扩增PigE基因下游臂,加下划线部分序列为hph基因部分序列。hph-F和hph-R用于从pCB1003载体中扩增hph基因。P1和P4用于进行三段连接反应,双下划线部分分别为KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点。
[0025] 表2 PigE基因5’侧翼序列和3’侧翼序列PCR扩增体系
[0026]
[0027]
[0028] (2)Double-joint PCR法连接PigE基因上下游臂、hph基因:PigE基因的5’侧翼序列、3’侧翼序列、hph基因序列加入PCR管中,进行两轮PCR反应。两轮PCR反应体系分别如表3、表4所示。第一轮PCR反应条件如下:98℃预变性4min,98℃变性30s,55℃退火10min,72℃延伸4min,循环数为15个,72℃终延伸10min,12℃保存。第二轮PCR反应条件如下:98℃预变性3min,98℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸3min,循环数为30个,72℃终延伸10min,12℃保存。
[0029] 表3第一轮PCR反应体系
[0030]反应成分 体积(μL)
dNTP 2
purified PigE 5,-flanking amplicon 1
purified PigE 3,-flanking amplicon 1
purified hph amplicon 3
5×prime STAR buffer 5
Prime STAR HS DNA Polymersae 0.25
ddH2O Up to 25
[0031] 表4第二轮PCR反应体系
[0032]反应成分 体积(μL)
dNTP 4
LA PCR buffer 2
LF 1
LR 1
Template 0.5
LA Taq DNA Polymersae 0.2
ddH2O Up to 25
[0033] PigE基因敲除盒和pKO1B质粒用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切,酶切后敲除盒用DNA清洁试剂盒纯化,pKO1B质粒酶切后跑电泳割胶回收,后用T4DNA Ligase连接,连接产物转化根癌农杆菌AGL-1菌株,菌液PCR验证,验证敲除载体。
[0034] 实施例2:根癌农杆菌介导的基因转化及敲除子的筛选
[0035] 1培养基
[0036] PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、pH 5.0~5.5。
[0037] LB液体培养基:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、pH 7.0。
[0038] IM液体培养基:pH 4.9,0.01mol/L的磷酸氢钾缓冲液0.8mL,硫酸镁-氯化钠溶液20mL,1%CaCl2·H2O溶液1mL,50%甘油溶液10mL,20%NH4NO3溶液2.5mL,20%葡萄糖溶液
10mL,补充蒸馏水至1000mL。
[0039] 使用时,每1mL培养基中加入0.01%FeSO4 10μL,100g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)10μL和0.1mol/L乙酰丁香酮(AS)4μL,混匀后马上使用,用于农杆菌的诱导培养。
[0040] Co-IM培养基:同IM,但是20%葡萄糖溶液只加5mL。使用时,先将培养基熔化,待温度稍降低后,每1mL培养基中加入0.01%FeSO4 10μL,100g/L MES 10μL和0.1mol/L AS8μL,混匀后马上使用,用于培养红曲霉孢子和农杆菌。
[0041] 2实验方法
[0042] 2.1红曲霉分生孢子悬浮液的制备
[0043] 将野生型红曲霉菌株接种于PDA培养基,30℃培养21d,后用5mL无菌水清洗培养平板,洗脱液经4层擦镜纸过滤,滤液即为红曲霉孢子悬浮液。将红曲霉孢子悬浮液离心后用无菌水重悬,血球计数板计数,配成浓度为105孢子/mL的红曲霉分生孢子悬浮液。
[0044] 2.2根癌农杆菌的活化与诱导培养
[0045] 将含有敲除载体的农杆菌AGL-1菌株在含有50μg/mL卡那霉素(Kan)、50μg/mL利福平(Rif)抗性的LB培养平板上划线培养2d。后挑取农杆菌单菌落接种于2mL含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,28℃、180r/min摇床培养12-16h。培养后的农杆菌菌液离心弃上清,菌体沉淀用诱导培养基IM(加入1mL 100mg/L MES,1mL 0.01%FeSO4,400μL 0.1mol/L AS)稀释,后28℃180r/min培养5-6h,至农杆菌菌液OD600=0.5。
[0046] 2.3农杆菌与红曲霉孢子洗脱液共培养
[0047] 将制备的红曲霉孢子悬浮液5000r/min离心10min,红曲霉孢子用经诱导活化培养获得的农杆菌菌液稀释,血球计数板计数稀释至红曲霉孢子悬浮液浓度为1×105个/mL。取上述红曲霉孢子与农杆菌混合液200μL涂布于硝酸纤维素膜上,后将硝酸纤维素膜贴于Co-IM培养基(加入1mL 100mg/L MES,1mL 0.01%FeSO4,800μL 0.1mol/L AS)表面,28℃培养3d。
[0048] 2.4hph抗性平板筛选转化子
[0049] 将硝酸纤维素膜转移到PDA选择培养基上(50μg/mL潮霉素、500μg/mL头孢霉素),30℃培养7d,将长出来的单菌落转接至含有50μg/mL潮霉素抗性的PDA平板上培养,抗性平板上再次长出的转化子接种于无抗的PDA平板上30℃培养7d,保藏于25%的甘油中储存于-
80℃冰箱备用。
[0050] 2.5PCR验证基因重组PigE缺失突变株
[0051] 提取步骤2.4中保藏的红曲霉转化子菌株基因组DNA,分别用引物hph-F/hph-R、PigE-F/Pig-R、P1/P4进行扩增,验证基因重组PigE缺失突变株,实验结果如图3所示。
[0052] 2.6基因重组PigE缺失突变株菌落及显微结构特征
[0053] 经筛选获得了1株菌落色泽发生显著变化的基因工程M-piy菌株。野生型菌株与M-piy菌株的菌落及显微结构特征如图4所示。M-piy菌株除红曲色素种类和产量发生变化外,M-piy菌株的生长速度、菌落、菌丝、分生孢子和闭囊壳等与野生型菌株没有明显差异。
[0054] 实施例3:PigE基因缺失M-piy菌株黄色素色价及桔霉素含量的检测[0055] 1培养基
[0056] PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、pH 5.0~5.5。用于菌株活化培养。
[0057] PD液体培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、pH 5.0~5.5。用于菌株种子培养。
[0058] YES液体培养基:酵母提取物4%、蔗糖16%、pH 5.5~6.0。用于菌株发酵培养。
[0059] 2实验方法
[0060] 2.1 M-piy菌株菌丝黄色素色价的检测
[0061] 将保藏的红曲霉野生型菌株和PigE基因缺失M-piy菌株分别接种到PDA培养基上,28℃活化培养7d。用打孔器取3个边缘菌饼(直径8mm)转接到装有100mL PD培养液的250mL三角瓶中,28℃、180r/min摇床上培养3d用作种子液。再将种子液按10%转接到YES液体培养基中(250mL三角瓶装100mL)、28℃、180r/min摇床上分别培养5d、7d、9d、11d、13d、15d、
17d、19d,取样检测不同培养天数下红曲霉野生型菌株与M-piy菌株菌丝黄色素的色价。
[0062] 称取0.05g红曲霉干菌丝,加入4mL 70%乙醇,漩涡震荡,60℃温育1h,12000rpm离心10min,取上清液测其在300nm-600nm处全波长扫描图谱,用分光光度计检测OD值(410nm、370nm)并计算黄色素色价。黄色素色价计算公式:黄色素色价=吸收峰处OD值×稀释倍数×20U/g
[0063] 2.2红曲霉发酵液桔霉素含量的检测
[0064] 培养方法同2.1。分别取不同培养时间发酵液(包括菌丝)1mL放入5mL的离心管中,加入等体积的甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7:3:1),剧烈震荡混匀,12000r/min离心10min,取上清液。采用高效液相色谱(HPLC)法检测桔霉素含量,色谱条件是:Agilent C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相是乙腈(A):酸水(B,磷酸调节pH 2.5)=75:25;λ=331nm、流速1mL/min、柱温30℃、进样体积20μL。
[0065] 3实验结果
[0066] 3.1 M-piy菌株色素提取液扫描图谱
[0067] 野生型菌株和M-piy菌株菌丝色素提取液300nm-600nm波长扫描图谱见图5,M-piy菌株菌丝色素提取液只有一个吸收峰,吸收峰为370nm左右;而野生型菌株菌丝色素提取液有2个吸收峰,吸收峰分别为410nm和520nm左右。
[0068] 3.2 M-piy菌株菌丝红曲黄色素的色价
[0069] 野生型菌株和M-piy菌株菌丝色素提取液黄色素色价见图6。M-piy菌株只产生红曲黄色素,红曲黄色素产量较野生型菌株提高了约9.6倍,达到了9232.86U/g,而野生型菌株红曲黄色素产量仅为958.23U/g。
[0070] 3.3 M-piy菌株发酵液桔霉素的含量
[0071] 野生型菌株和M-piy菌株发酵液桔霉素含量检测结果见图7。M-piy菌株产桔霉素的发酵时间较原始野生型菌株延长,桔霉素含量显著降低,发酵7d后才开始产生桔霉素,发酵15d后桔霉素含量仅为0.31mg/L,是野生型菌株的0.22倍。