[0036] 下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
[0037] 实施例1 米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株的分离、筛选和鉴定[0038] 1培养基
[0039] ①PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、水1L、pH 5.0~5.5。用于曲霉菌株的分离、纯化、活化和鉴定。
[0040] ②种子培养液:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L、pH 5.0~5.5。用于产Lovastatin曲霉各菌株的种子培养。
[0041] ③发酵培养液:马铃薯20%、葡萄糖2%、玉米粉3%、牛肉膏1.0%、水1L、pH5.0~5.5。用于发酵产Lovastatin曲霉各菌株的筛选。
[0042] 2实验方法
[0043] 2.1曲霉菌株的分离纯化
[0044] 从不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面,28℃培养1d,待白色绒毛状菌丝长出后,用牙签取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后,显微镜观察具有曲霉的典型特征,挑取少许边缘菌丝纯化3次,得性状均一的曲霉纯菌株。将获得的曲霉纯菌株编号后保存于25%甘油中,置于-20℃冰箱保藏备用。
[0045] 2.2高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
[0046] 用高效液相色谱法(HPLC)检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量筛选。曲霉各保存菌株28℃PDA平板活化培养3d后;用打孔器取2菌饼(直径8mm)转接种于种子培养液中,28℃、200r/min摇床培养2d作为种子液;按10%接入种子液至装有100mL发酵培养液的三角瓶中,28℃、200r/min摇床培养4d,发酵液用于Lovastatin的检测。
[0047] 取上述发酵液1mL,加甲醇4mL(按1:4的比例),超声处理20min,50℃水浴2h,3000r/min离心3min,取上清液,经0.45μm滤膜过滤,利用HPLC法检测Lovastatin产量,筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。
[0048] 2.3 Ao-57菌株的形态观察和鉴定
[0049] 用镊子挑取少量该菌株菌丝,转接于PDA培养基平板上,活化培养3d;取1菌饼(直径8mm)接种于新的PDA培养基平板上,28℃,培养3d,显微镜观察Ao-57菌株的生长、菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征,并拍照。提取Ao-57菌株的基因组DNA,扩增ITS rDNA基因,送上海生物工程公司测序。
[0050] 3实验结果
[0051] 3.1曲霉菌株的分离纯化和高产Lovastatin菌株的筛选
[0052] 通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)中分离纯化共获256株曲霉纯菌株。
[0053] 利用高效液相(HPLC)法对256株曲霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测,结果表明不同曲霉菌株Lovastatin产量存在显著差异(附图1)。经筛选获1株Lovastatin产量较高的曲霉菌株,编号为Ao-57菌株,Lovastatin产量为175.74mg/L,Ao-57菌株分离自自然发酵的黄豆。
[0054] 3.2曲霉Ao-57菌株的形态特征和鉴定结果
[0055] 曲霉Ao-57菌株的形态特征:PDA培养基上的菌落生长较快,质地疏松,初期为白色绒毛状,后变为黄褐色,背面淡黄色。培养15d菌落直径达80mm(附图2);显微镜观察菌丝光滑,有隔膜,直径6μm~8μm的分支状;分生孢子头放射状,直径100μm~150μm;分生孢子梗长短不一;顶囊烧瓶形,直径50μm~60μm,表面近于光滑;小梗一般为单层,瓶梗15~25μm×5.0~6.5μm,偶尔有双层,也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上(附图3,图4);分生孢子球形或近球形,大小8.0~9.0μm×6.5~7.5μm,表面近于光滑(附图5)。
[0056] ITS rDNA基因序列分析结果表明,其长度为568bp(附图6),与米曲霉(Aspergillus oryzae)相似度最高,为99%(附图7)。根据Ao-57菌株的形态特征和ITS rDNA基因序列,结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表,将Ao-57菌株鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
[0057] 实施例2 米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产生规律
[0058] 1菌株:米曲霉Ao-57菌株。
[0059] 2培养基
[0060] ①PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、水1L、pH 5.0~5.5。用于曲霉菌株的活化。
[0061] ②一级种子培养液:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L、pH 5.0~5.5。用于曲霉Ao-57菌株的一级种子培养。
[0062] ③二级种子培养液:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L、pH 5.0~5.5。用于曲霉Ao-57菌株二级种子培养。
[0063] ④发酵培养液:乳糖6%、甘油2%、玉米粉3%、蛋白胨1.5%、酵母膏0.5%、MgSO4●7H2O0.1%、KH2PO4 0.1%、NaCl 0.2%、水1L、pH 5.0~5.5。用于曲霉Ao-57菌株发酵生产Lovastatin。
[0064] 3实验方法
[0065] 3.1米曲霉Ao-57菌株的培养
[0066] 用接种针挑少量Ao-57菌株菌丝,转接于PDA培养基平皿中,活化培养3d;取平皿中2菌饼(直径8mm)接种于PD培养液中,摇床培养3d,制得一级种子液;在二级种子培养液中,按10%接入一级种子液,200r/min摇床培养2d成二级种子液;在5L发酵罐发酵培养液中按
20%接入二级种子液进行发酵培养。
[0067] 3.2米曲霉Ao-57菌株菌丝干重的测定
[0068] 1.5mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干,称取空离心管质量为m;每管吸取1mL培养液,在4℃,10000r/min离心10min,弃上清;加无菌蒸馏水洗3次,10000r/min离心10min,弃上清,放入85℃烘箱中烘至恒重,称取质量为M;菌丝干重质量为M-m。每隔4h取1mL Ao-57菌株发酵液测定菌丝干重。以发酵时间为横坐标,Ao-57菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。
[0069] 3.3米曲霉Ao-57菌株发酵过程中Lovastatin产量分析
[0070] 每隔4h取发酵液1mL,加甲醇4mL(按1:4的比例),超声处理20min,50℃水浴2h,3000r/min离心3min,取上清液,经0.45μm滤膜过滤,HPLC法检测Lovastatin产量,以发酵时间为横坐标,Ao-57菌株的Lovastatin产量为纵坐标,绘制Ao-57菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
[0071] 3.4米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin的分离纯化和鉴定
[0072] 米曲霉Ao-57菌株5L发酵罐发酵108h~144h,过滤发酵液,乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin成分,与滤液混合;用制备型高效液相分离纯化Lovastatin,蒸干后得晶体;将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中,核磁共振波谱技术分析鉴定。
[0073] 4实验结果
[0074] 4.1米曲霉Ao-57菌株的生长曲线
[0075] 每隔4h取样测定菌丝干重,Ao-57菌株生长曲线见图8。Ao-57菌株0~20h生长速度慢,为迟缓期;24h~68h快速生长,菌体量大增,为对数生长期;发酵至72h后,长势趋于平缓,菌体量达到最高,为稳定生长期,菌丝干重达305.19g/L;108h后出现泡沫,进入衰亡期。
[0076] 4.2米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线
[0077] 每隔4h取样用HPLC法测定Ao-5菌株发酵液Lovastatin产量,Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图8,发酵至108h后,发酵液中Lovastatin产量基本稳定,最大值为350.09mg/L。
[0078] 4.3米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin的提取物及其鉴定
[0079] 用制备型高效液相分离纯化发酵液中的Lovastatin,经旋转蒸发仪蒸干后得到微黄色Lovastatin提取物晶体;用核磁共振波谱技术对Lovastatin标准品和发酵液中Lovastatin提取物分析比对,结果表明Lovastatin提取物结构(图10)与Lovastatin标准品(图9)一致,纯度较高。