[0007] 为解决上述问题，本发明的目的是将耐低温高效降解PAHs真菌与细菌联合固定在蛭石上，构建固定化噬低温真菌‑细菌共生体系，为冻融交替条件下PAHs污染土壤微生物原位修复提供最佳技术途径。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒，以酸处理的蛭石为载体，采用吸附法固定混合菌剂；所述的混合菌剂由保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:1混合组成。
[0009] 上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒，所述的酸处理的蛭石的制备方法是：按固液比1∶20，将蛭石和HCl混合均匀，80‑85℃恒温水浴搅动2h，蒸馏水冲洗，烘干，再于马弗炉500℃焙烧6h，得酸处理的蛭石。
[0010] 上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 1)混合菌剂的制备：将保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:1，接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，制得混合菌剂；
[0012] 2)载体预处理：按固液比1∶20，将蛭石和HCl混合均匀，80‑85℃恒温水浴搅动2h，蒸馏水冲洗，烘干，再于马弗炉500℃焙烧6h，得酸处理的蛭石；
[0013] 3)载体固定化：将酸处理的蛭石121℃高温灭菌60min，按1.0ml/g的固液比，用增殖培养液浸润酸处理的蛭石，培养12～24h后；按10％接种量加入步骤1)制备的混合菌剂，15℃恒温培养，每24h补加一次增殖培养液，连续补加3次后，再继续15℃恒温培养4～5d，得蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒。
[0014] 上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒的制备方法，所述的完全培养基是牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
[0015] 上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒的制备方法，所述的增殖培养液是蔗糖4g，酵母膏3g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2HPO4 2g，MgSO4·H2O 0.25g，pH 6.0～6.5，121℃灭菌20min。
[0016] 上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒在降解冻融土壤中多环芳烃污染物中的应用。方法如下：于含有多环芳烃污染物的冻融土壤中，加入上述的蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒，补加或不补加水，使土壤含水量为20～30％。
[0017] 所述的多环芳烃是由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物。优选的，所述的多环芳烃是菲、芘和苯并[a]芘。
[0018] (一)本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4的筛选方法如下：
[0019] 从沈抚灌渠采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于‑20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源－1浓度法进行驯化，于15℃，120r·min 摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始－1 －1
浓度为10、10与5mg·L ，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L ，第3次转接浓度增加至－1 －2 －3 －4 －5 －6
30、30与15mg·L 。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10 、10 、10 、10 和10 稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出4株细菌，记为SDR2‑SDR5。将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬
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液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×10CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为‑5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果SDR4效果显著。
[0020] 菌株SDR4，在牛肉膏蛋白胨平板上呈淡黄色，不透明，呈革兰氏阴性，短杆状，边缘整齐，不形成芽孢，好氧。
[0021] 菌株SDR4基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor‑joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图1可见，SDR4菌与假单胞菌属的16S rDNA序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株SDR4归属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
[0022] 无机盐液体培养基包括：K2HPO41.0 g，(NH4)2SO4 5g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，pH7.0～7.2，蒸馏水1L定容，121℃灭菌25min，营养培养基(CM培养基)：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，pH 7.0～7.2，以蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌25min，固体培养基另加琼脂粉20g/L。
[0023] (二)本发明提供的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7的筛选
[0024] 从鸡西污染地采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于‑20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓－1度法进行驯化，于15℃，120r·min 摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始浓－1 －1
度为10、10与5mg·L ，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L ，第3次转接浓度增加至30、－1 －2 －3 －4 －5 －6
30与15mg·L 。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10 、10 、10 、10 和10 稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出真菌3株，记为JDR6‑JDR8，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实
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验模拟土壤中，其菌浓度为6×10CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为‑5℃冻结12h，
15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果JDR7效果显著。
[0025] 菌株JDR7，在牛肉膏蛋白胨平板上呈白色，生长初期成花瓣状，后期菌丝发达.生长繁密，在扫描电镜下观察呈管状，是一种具有良好的食品安全评估记录的工业产油好氧真菌。
[0026] 菌株JDR7基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor‑joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图2可见，JDR7菌与被孢霉的ITS序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株JDR7归属于被孢霉。
[0027] 本发明的有益效果是：本发明，应用的菌为耐低温高效PAHs降解菌，在寒冷地区其活性不会受到抑制，另外，所用蛭石，改性后晶片破裂，呈现多孔的特征，比表面积提高，吸附性增强，为微生物提供了更多的吸附位点，从而提高了固定化微生物数量，使得降解率最高，其成本低，制备工艺简单，不会引入二次污染，不需要回收。此外，蛭石固定化混合菌的微环境能有效屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能。经SEM(扫描电镜)观察到，载体蛭石改性后变得多孔，可提高微生物的浓度，将固定化混合菌投放到含PAHs污染的土壤中，对寒冷地区多环芳烃污染的冻融土壤的修复效果明显。60d后，对Phe、Pyr和BaP的去除率分别为64.38％、48.71％和40.19％。
