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一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2015-11-20

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2016-03-09

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2018-11-13

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2035-11-20

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201510808866.X	申请日	2015-11-20
公开/公告号	CN105316413B	公开/公告日	2018-11-13
授权日	2018-11-13	预估到期日	2035-11-20
申请年	2015年	公开/公告年	2018年
缴费截止日
分类号	C12Q1/686 、C12Q1/04	主分类号	C12Q1/686
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	4
权利要求数量	5	非专利引证数量	1
引用专利数量	3	被引证专利数量	0
非专利引证	1、说明书第47页第269-270段. Kamal Rai Aneja et al..EmergingPreservation Techniques for ControllingSpoilage and Pathogenic Microorganisms inFruit Juices《.International Journal ofMicrobiology》.2014,第2014卷第2页. 王芳.食品中桔霉素的检测、降解特性及其控制技术的研究《.中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技辑》.2013,(第9期),要第2页,正文第6页第5段.;
引用专利	CN103361439A、WO03/097868A1、CN103874411A	被引证专利
专利权维持	7	专利申请国编码	CN
专利事件	许可	事务标签	公开、实质审查、授权、实施许可

申请人信息

申请人	杭州电子科技大学	第一申请人	杭州电子科技大学
专利权人	杭州电子科技大学	当前专利权人	杭州电子科技大学
发明人	沈洁	第一发明人	沈洁
地址	浙江省杭州市杭州经济技术开发区白杨街道2号大街1158号	邮编	310018
申请人数量	1	发明人数量	1
申请人所在省	浙江省	申请人所在市	浙江省杭州市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

杭州君度专利代理事务所

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

杜军

摘要

本发明公开一种可同时检测果汁饮料中污染菌的基因快速筛查方法。该方法包括果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现检测样品中是否含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

摘要附图
说明书附图：abs-1
说明书附图：图1
说明书附图：图2

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2023-01-31	专利实施许可合同备案的生效	IPC(主分类): C12Q 1/686 合同备案号: X2023980030245 专利申请号: 201510808866.X 申请日: 2015.11.20 让与人: 杭州电子科技大学受让人: 杭州电子科技大学绍兴柯桥智慧农业研究院有限公司发明名称: 一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法申请公布日: 2016.02.10 授权公告日: 2018.11.13 许可种类: 普通许可备案日期: 2023.01.09
2	2018-11-13	授权
3	2016-03-09	实质审查的生效	IPC(主分类): C12Q 1/68 专利申请号: 201510808866.X 申请日: 2015.11.20
4	2016-02-10	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480 μ L 再加入10mg/mL溶菌酶120 μ L ，
37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ L ，由100nM正向混合引物2 μ L ，100nM反向混合引物2 μ L ，25mM的MgCl2 4 μ L ，5×PCR Buffer 4 μ L ，5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μ L ，DNA模板1 μ L ，余量的双蒸水组成；其中引物体系为步骤(1)得到的SEQ ID NO.1～8引物体系；
步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；
步骤(4)、检测鉴定：
步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉(Penicillium citrinum)；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉(Aspergillus niger)。

2.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1。

3.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃
30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。

4.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离体系：1 μ L 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5 μ L ，400bp DNA Marker 0.5 μ L 混合均匀。

5.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。

说明书

技术领域

[0001] 本发明属于果汁饮料中污染菌检测方法，特别是一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，涉及一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，用于几种常见果汁饮料中污染菌的基因快速筛选方法。

背景技术

[0002] 果汁是人们生活中喜爱的液体饮料之一，是以水果为原料经过物理方法如压榨、离心、萃取等得到的汁液产品。果汁饮料，尤其是纯果汁里富含身体必需的维生素和微量元素。随着消费者的健康意识增强，果汁饮料的消费量日益增加。

[0003] 果汁饮料生产加工过程中可能会污染一些病原微生物，在运输和储存中，暴露于非冷藏环境会加剧污染菌的增殖，从而造成异味物质和引起果汁饮料浑浊，从而引起果汁饮料变质，危害消费者的健康。如何能够快速、有效的检测果汁饮料中是否存在污染菌成为本领域亟待解决的问题。

[0004] 对于果汁饮料中微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数果汁饮料厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对果汁饮料生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品果汁饮料质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。

[0005] 大量实验已证实，几种果汁饮料污染菌桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger，可经受果汁巴氏杀菌过程而存活，从而对高温消毒处理后的果汁仍能造成危害。这几种污染菌的鉴别是一项较复杂的工作，这些微生物需要较长的培养孵育时间，检测过程复杂，因而有必要进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为培养基的传统培养法，或者使用单重PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服果汁饮料中几种污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在污染菌污染的检测。

[0007] 本发明的技术方案是：

[0008] 本发明针对4种污染菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种污染菌，则说明样品中含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。

[0009] 一种果汁饮料污染菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种污染菌的基因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-8。

[0010] 本发明方法具体如下：

[0011] 步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：

[0012] 将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；

[0013] 步骤(2)、多重PCR扩增：

[0014] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；

[0015] 所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，余量的双蒸水组成；其中正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1；

[0016] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

[0017] 表1本发明用于污染菌的基因检测的4重引物体系各引物序列

[0018]

[0019] 步骤(3)、毛细管电泳分离条件：

[0020] 分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；

[0021] 分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；

[0022] 步骤(4)、检测鉴定：

[0023] 步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉Penicillium citrinum；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母Saccharomyces cereviseae；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉Aspergillus niger。

[0024] 表2果汁饮料污染菌基因特征峰位置

[0025]

[0026] 与现有技术相比本发明具有如下特点：

[0027] 其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定果汁饮料中是否存在污染菌，且检测结果准确；

[0028] 其二，通过分析基因确定桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger在果汁饮料中的微量存在，及时发现果汁饮料中有害菌，实现有效的监测及预防作用；

[0029] 其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

实施方案

[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

[0033] 实施例1：

[0034] (1)果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：

[0035] 挑取平板培养基上长出的桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger单菌落加入10mL成品苹果汁中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入
120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。

[0036] (2)四重PCR扩增

[0037] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；(3)毛细管电泳分离条件

[0038] 分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；

[0039] 使用贝克曼库尔使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果图1所示，在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处均出现特征峰，故四种污染菌基因被检出，认为检测过程果汁对检测结果没有影响，使用本发明能够捕捉到样品中桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger基因的特征峰。

[0040] 实施例2：

[0041] 取某果汁饮料厂生产车间500mL的果汁10瓶，使用孔径为0.45μm的滤膜分2次进行过滤，每次使用1片滤膜过滤250mL；对一片滤膜使用黑曲霉Aspergillus niger检测培养基察氏培养基在26℃，经7天厌氧培养后检测得到18个菌落，并以此作为实验对照；对另一片滤膜，使用1mL无菌水进行震荡洗涤，收集洗涤液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司GenomicDNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料污染菌的DNA模板。

[0042] 多重PCR反应体系使用Thermo-DNA Polymerase DNA试剂盒，使用3重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为
1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

[0043] 毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min，使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管电泳谱图。结果如图2所示，在247bp相应位置处出现特征峰，则判断检测出黑曲霉Aspergillus niger，说明样品中含有具有果汁饮料污染能力的黑曲霉，且与对照培养实验结果相吻合。

[0044] 实施例3：

[0045] 乳酸菌(Lactobacillus)是果汁饮料中另一种常见污染菌。本实例可以证明本发明对桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger的检测特异性，即本发明的检测方法在仅乳酸菌(Lactobacillus)存在情况下，未显示特征峰，即说明乳酸菌(Lactobacillus)存在不会对检测产生干扰。

[0046] 本实例再采用常见污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum作为干扰菌。操作步骤如实施例1或2所述。

[0047] (1)污染菌的培养及DNA模板提取：

[0048] 分别挑取平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum单菌落加入10mL成品果汁中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。

[0049] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；
70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

[0050] (3)毛细管电泳分离条件

[0051] 分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；

[0052] 使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果显示，没有特征峰出现，即平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的存在对检测结果均没有影响，不会出现假阳性结果。

[0053] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

附图说明

[0030] 图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；

[0031] 图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。

1同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法 2同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法 3一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法