同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法   0    0

本发明公开一种同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法。该方法利用由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒酵母和发酵过程中是否存在污染酵母菌的检测。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种啤酒污染酵母菌Pichia fermentans,Candida mesenterica,Hansenula polymorpha，Rhodotorula glutinis，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

1.同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、啤酒污染酵母菌DNA模板提取：
采用通用的DNA提取方法和纯化方法，从酿酒用高浓度酵母菌中取样品，或从酿酒过程中麦汁或发酵液中取样品，提取得DNA；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增， 得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ l ， 由100nM正向混合引物2 μ L ，100nM反向混合引物2 μ L ，25mM的MgCl2 4 μ L ，5×PCR Buffer 4 μ L ，5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μ L ，DNA模板1 μ l 和余量双蒸水；其中正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1；
步骤(3)、毛细管电泳分离条件；
步骤(4)、检测鉴定：
将所述步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为142bp、147bp、335bp、
359bp相应位置处出现特征峰；若在142bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Pichia fermentans；若在147bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Candida mesenterica；若在335bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Hansenula polymorpha；若在359bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Rhodotorula glutinis。

2.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃
30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。

3.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离体系：1 μ L 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5 μ L ，400bp DNA Marker 0.5 μ L 混合均匀。

4.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。