同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法   0    0

本发明公开一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法。该方法是利用由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在耐热菌污染的检测。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料耐热菌酸土环脂芽孢杆菌、球孢枝孢、腐败霉菌、丝衣霉花，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

1.一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、果汁饮料耐热菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养，再通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上，将滤膜转移至反应试管，然后依次加入50mM EDTA 480 μL 、10mg/mL溶菌酶120 μL ，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料耐热菌的DNA模板；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20 μL ， 由100nM正向混合引物2 μL ，100nM反向混合引物2 μL ，25mM的MgCl2 4 μL ，5×PCR Buffer 4 μL ，5U/μL 的Taq聚合酶0.7 μL ，DNA模板1 μL 和余量双蒸水组成；其中引物体系为步骤(1)得到的SEQ ID NO.1～8引物体系；
步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；
步骤(4)、检测鉴定：
将步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为171bp、256bp、265bp、326bp相应位置处出现特征峰；若在171bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)；若在256bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)；若在265bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有腐败霉菌Neosartoria fischeri；若在
326bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有丝衣霉花(Byssochlamys spectabilis)。

2.如权利要求1所述的一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1。

3.如权利要求1所述的一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s，58℃
30s，70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。

4.如权利要求1所述的一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离体系：1 μL 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5 μL ，400bp DNA Marker 0.5 μL 混合均匀。

5.如权利要求1所述的一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。