[0026] 为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0027] 需要说明的是，实施例中WT：野生型；MT表示突变体；pET‑28b‑MDHm表示突变质粒。
[0028] 为了解决现有技术中用于拆分D,L‑苹果酸的野生型苹果酸脱氢酶均存在耐热性能较差，在自然状态下筛选耗时较长，工序繁琐，不利于苹果酸脱氢酶在实现D,L‑苹果酸的拆分，以及其他方法合成D‑苹果酸的提纯的应用的问题，本发明提供的一种热稳定性苹果酸脱氢酶基因的构建方法，采用包括质粒准备，突变引物设计，PCR扩增突变质粒，消化模板质粒和转化筛选步骤的方法构建而成，其中，构建的基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
[0029] 氨基酸组成是酶耐热的重要因素，脯氨酸和丙氨酸残基能更好的稳定蛋白质骨架结构，同时在二聚体之间，一些带电荷的氨基酸所形成的离子间相互作用有助于提高酶的热稳定性和催化活性。以原生表达质粒基因序列为模板，采用设计的突变引物，进行快速点突变PCR扩增突变质粒，转化菌抗性筛选，构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，并将构建的突变的苹果酸脱氢酶基因转到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株中进行表达，本发明表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶热稳定性高且活性高的特性，为D‑苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。
[0030] 具体的本发明实施例提供的一种热稳定性苹果酸脱氢酶基因的构建方法，包括如下步骤：
[0031] 突变位点的选择：经过计算机软件辅助预测，通过增加一个碱基可使突变质粒发生通读，从而使大肠杆菌表达载体PET‑28b(+)中的序列翻译为13个氨基酸残基Ala‑Arg‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Pro‑Pro‑Leu‑Arg‑Ser‑Gly‑Cys，Pro和Ala能更好的稳定蛋白质骨架结构，增加酶蛋白的热稳定性。另外，包含的极性氨基酸倘若在分子的表面，不仅能增强酶蛋白的溶解性，同时增加酶分子表面电荷的相互作用，形成盐键以提高酶蛋白的热稳定性。因此，本发明是实施例在969位点增加一个G碱基造成延伸突变从而加长肽链并可获得大肠杆菌上的这13个氨基酸残基。MT中MaMDH第323位以后的氨基酸残基替换，C端增加14个氨基酸，其中包括大肠杆菌上的这13个氨基酸残基。如表1所示。
[0032] 表1 MaMDH的突变位点选择
[0033]
[0034] 质粒准备：根据GenBank中铜绿微囊藻PCC7806 MDH的基因序列为模板A，将模板A与载体pET‑28b(+)同时双酶切后通过T4 DNA连接酶连接，得原生表达质粒pET‑28b‑MDH。
[0035] 突变引物设计：根据GenBank中铜绿微囊藻PCC7806 MDH的基因序列和pET‑28b(+)特征，用Primer 5.0软件设计MDH突变引物，设计的突变引物包含：
[0036] (1)上游引物：5'‑TGACAGTCTCAAGGGTTTTGATGTA‑3'；
[0037] (2)下游引物：5'‑CCCTTGAGACTGTCAAGAGCTAAAT‑3'。
[0038] PCR扩增突变质粒：以原生表达质粒pET‑28b‑MDH的基因序列为模板在设计的上、下游引物作用下进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性7min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，35个循环；72℃延伸5min，获得含突变基因的突变重组质粒。
[0039] 对PCR扩增的结果即突变重组质粒进行凝胶检测，结果如图1所示，图1中M泳道是5000bp Marker，泳道1是扩增后的突变重组质粒，PCR扩增使用快速高保真FastAlteration DNA聚合酶，反应体系参照酶说明书。图1中显示一明亮条带位于5000bp上方，表明含有突变型MaMDH的重组质粒被成功克隆。
[0040] 消化模板质粒：将经过PCR扩增的产物用DpnⅠ进行酶切消化，配置酶切体系：50μL PCR产物、1μL消化酶(20U/μL)，充分混匀后于37℃消化1h，利用DpnⅠ消化甲基化的模板质m粒，留下扩增得到的突变质粒pET‑28b‑MDH。
[0041] 得到的突变质粒pET‑28b‑MDHm做NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切结果如图2，图2中M泳道是2000bp Marker，泳道1是突变质粒双酶切，经过与Mark对比，图2中亮带与预期结果相符，预计得到突变后的基因片段。突变质粒通过测序验证突变位点准确，在969位点增加一个G碱基。测序结果如SEQ ID NO.1所示。
[0042] 转化筛选：将突变质粒转化到感受态细胞大肠杆菌E.coli DH5α中，经过卡那霉素抗性筛选后，提取质粒，得热稳定性苹果酸脱氢酶的突变质粒。
[0043] 蛋白表达：诱导表达热稳定性苹果酸脱氢酶的突变质粒于E.coli Rosetta(DE3)中，将转化成功的E.coli Rosetta菌液接种到含卡那霉素(30μg/mL)和氯霉素(30μg/mL)的5mL LB液体培养基中，在转速225rpm、37℃下过夜培养，吸取1mL培养菌液加入至200mL LB培养基中，转速225rpm、37℃下培养至菌液浓度OD600达到0.5时加入0.5～0.7mM IPTG诱导，在转速180rpm，20℃下低温诱导18～20h，在转速5500rpm、4℃下离心5min分离得到菌体，向菌体中加入pH值为8.0的磷酸盐缓冲液；
[0044] 用Clontech公司的细胞破碎液 x Tractor Buffer破碎细胞；
[0045] 破碎液于10000rpm、4℃下离心20min，将上清转移到树脂中；
[0046] 使用Clontech公司的金属离子亲和柱( purification Kit)纯化收集突变型融合蛋白；
[0047] 使用SDS‑PAGE对纯化出的蛋白进行电泳检测，结果如图3。
[0048] 图3中泳道M是蛋白质分子量标准；泳道2是MT经0.5mM IPTG诱导后的细胞粗提物；泳道1是MT经纯化的蛋白质。通过泳道对比可以看出，图中在蛋白质分子量标准条带40kDa左右，证明诱导表达成功并且异源表达的蛋白质被纯化完全。
[0049] 具体的，本发明实施例提供的一种热稳定性苹果酸脱氢酶基因的构建方法，流程图如图5所示。
[0050] 为了验证上述构建的基因表达的苹果酸脱氢酶的热稳定性和酶活性，本发明实施例对表达的苹果酸脱氢酶进行了如下性能测试。酶活力测试原理：苹果酸脱氢酶在催化草+酰乙酸与苹果酸之间的可逆转换的同时，也催化NAD(P)H和NAD(P) 之间的转化。鉴于NAD(P)H在340nm处有各自的最大吸收峰，因此通过监测反应在340nm下的光吸收值变化即可测+
定酶的活力。反应体系：Tris‑HCL(pH 8.0)、草酰乙酸、NADH、L‑苹果酸、NAD。按上述反应体系(1mL)，999μL反应液加入1μL纯化后的酶液，颠倒混匀；用Cary 300Bio UV‑Visible分光光度计，340nm下测定。每个实验独立重复3～4次；1个酶活单位(U)定义为：每分钟消耗1μM NAD(P)H所需的酶量。
[0051] (1)酶热稳定性测定
[0052] 将反应体系中NADH浓度固定为0.16mM，OAA浓度0.25mM，将酶置于不同温度(20～78℃)中水浴加热20min，取出后冰浴5min，在340nm吸光度下检测斜率的变化。通过将酶促反应速率最高的反应作为标准反应，用与它的比值来反应影响的程度，其结果如图4所示。
本实验的突变体MT，在70℃时活力维持在80％以上，而WT活力已下降到70％以下，当达到78℃MT仍具有10％活力，MT较WT尤其是在60℃以上热稳定性有所提高。
[0053] (2)酶动力学测定
[0054] 动力学参数可以衡量酶的催化效率和天然特性。
[0055] Km值可以判断酶的专一性和天然底物：有的酶可作用于几种底物，Km值随底物不同而异，由此可帮助判断酶的专一性，1/Km可近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km越大，表明亲和力越大；Km最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。
[0056] kcat表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子(或是每个活性部位)转换底物的分‑1子数，这个常数又叫转换数(简称TN)，通称为催化常数，单位为s ，kcat越大，表示酶的催化效率越高。
[0057] 而kcat/Km比值的大小，可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。比值越大，效率越高。通过测定酶的动力学参数可以反映一个酶的催化性质。
[0058] 在25℃、100mM Tris‑HCl(pH 8.0)、0.3mM OAA下，变换NADH的浓度，检测A340的变化，每个NADH的浓度平行独立检测3～4次取平均值，分析突变型和野生型重组MaMDH的催化效率；同时，使用Graph pad 5.0软件中的米氏方程非线性拟合方法计算NADH的Km和kcat值。测试具体数据见表2。
[0059] 表2野生型和突变型MaMDH的酶动力学参数
[0060]
[0061] 数据显示，本发明实施例构建的MT突变体中，突变后对NADH的亲和性((KmNADH)增强为WT的1.6倍，且对NADH的偏爱性(kcat/Km)增加到原来的2.6倍，催化活力增长为WT的1.6倍。
[0062] 所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0063] 本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
