实施方案
[0018] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0019] 一种源于虾仁加工下脚料的锌螯合肽及其制备方法，制备工艺流程如下：虾仁加工下脚料-蛋白提取、酶解-酶解物-超滤-大孔树脂纯化-固定化锌离子层析柱层析凝胶过滤层析-RP-HPLC制备-锌螯合肽。
[0020] 实施例：
[0021] 1）虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备：将冷冻虾仁加工下脚料（虾头和虾壳）用组织捣碎机粉碎，按照料液比1 g：5 mL加入磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0），于47℃下于超声功率500W下超声90 min，然后加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×104 U/g），于47℃保温2 h后，温度升至95℃并保持10 min；溶液温度降至37℃，pH调至 7.8，加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g）保温3 h后，温度升至95℃并保持10min后，于10 000g离心15 min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物。
[0022] 2）虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备：将制备的酶解物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到虾仁加工下脚料锌螯合肽。利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
[0023] ①固定化锌离子层析柱层析: 将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，以0.5～1.5 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3～5柱体积的水和0.1 mol/L NaCl洗脱，收集0.1 mol/L NaCl洗脱组分，即为亲和层析组分。
[0024] ②凝胶柱层析：将上述胶原肽混合物（亲和层析组分）溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物（F3）（图1）；
[0025] ③RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量8～10 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：15%乙腈；洗脱速度0.5～0.8 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽（图2）。
[0026] ④结构检测：Zn螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM），ESI/MS检测分子量为1027.20 Da（图3）。
[0027] Zn螯合胶原肽对锌离子的螯合作用采用EDTA 滴定法测定。取螯合物100 mg 于100 mL小烧杯中，加水50 mL，滴入HCl（6 mol/L）数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0 mL于三角瓶，平行3 份，加入pH 10的NH3-NH4Cl缓冲液l0 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA 液滴定至蓝色；记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
[0028] 测定结果表明：纯化得到的Zn螯合胶原肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM）对锌离子的螯合能力为83.56 μg/mg，与胶原蛋白酶解产物（30.12 μg/mg）相比其对Zn的螯合能力具有出乎意料的效果。
[0029] 最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
[0030] 序列表
[0031] SEQUENCE LISTING
[0032] <110> 浙江海洋学院
[0033] <120> 虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法
[0034] <130> zjou-2015-wb0705
[0035] <160> 1
[0036] <170> PatentIn version 3.5
[0037] <210> 1
[0038] <211> 8
[0039] <212> PRT
[0040] <213> 人工合成
[0041] <400> 1
[0042] Trp Gly Phe Thr Cys Trp Pro Met
[0043] 1 5
