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一种基于DNA-银纳米簇(DNA-AgNCs)适体传感器的用途以及检测方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2014-04-23

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2014-08-06

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2016-09-14

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2034-04-23

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201410166731.3	申请日	2014-04-23
公开/公告号	CN103913443B	公开/公告日	2016-09-14
授权日	2016-09-14	预估到期日	2034-04-23
申请年	2014年	公开/公告年	2016年
缴费截止日
分类号	G01N21/64 、G01N33/68	主分类号	G01N21/64
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	4
权利要求数量	5	非专利引证数量	4
引用专利数量	4	被引证专利数量	0
非专利引证	1、Jing-Jing Liu et al.Label-free and fluorescence turn-on aptasensor for protein detection via target-induced silver nanoclusters formation.《Analytica Chimica Acta》.2012,第749卷; 2、Alfonso Latorre et al.Fluorescent DNA Stabilized Silver Nanoclusters as Biosensors.《Journal of Chemistry》.2013,第2013卷; 3、Xiao-Hai Yang et al.A novel fluorescent detection for PDGF-BB based on dsDNA-templated copper nanoparticles.《Chinese Chemical Letters》.2013,第25卷; 4、马坤.DNA-Ag 纳米簇的合成及生物传感研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》.2013,(第2期),;
引用专利	CN103630521A、WO2013064885A1、US2011212540A1、US2009269853A1	被引证专利
专利权维持	4	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	安徽师范大学	第一申请人	安徽师范大学
专利权人	安徽师范大学	当前专利权人	安徽师范大学
发明人	王广凤、朱艳红、陈玲	第一发明人	王广凤
地址	安徽省芜湖市弋江区花津南路安徽师范大学	邮编
申请人数量	1	发明人数量	3
申请人所在省	安徽省	申请人所在市	安徽省芜湖市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

芜湖安汇知识产权代理有限公司

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

朱圣荣

摘要

本发明涉及一种基于DNA‑银纳米簇(DNA‑Ag NCs)适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法，以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA‑Ag NCs，此DNA‑Ag NCs具有光稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜在应用价值。通过PDGF‑BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA‑Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA‑Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF‑BB高灵敏、高选择性的检测。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3(A)
说明书附图：图3(B)
说明书附图：图3(C)
说明书附图：图3(D)
说明书附图：图4(A)
说明书附图：图4(B)
说明书附图：图5
说明书附图：图6

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2016-09-14	授权
2	2014-08-06	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 21/64 专利申请号: 201410166731.3 申请日: 2014.04.23
3	2014-07-09	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1. 一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的用途，其特征在于，用于无标记检测血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)，检测过程中添加血晶素(hemin)及K+，其中，基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器采用如下步骤制备：(1)DNA探针加热一定时间后自然冷却并培养一段时间；(2)DNA溶液加入AgNO3后振荡；(3)黑暗中放置一段时间；(4)溶液中加入NaBH4，振荡，黑暗中放置；(5)得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

2.一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、Apt-G4探针加热数分钟后自然冷却培养一段时间；
b、步骤a得到溶液加入一定浓度AgNO3并振荡；
c、步骤b得到溶液黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并振荡；
d、步骤c中溶液加入不同浓度的PDGF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

3.如权利要求2所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的检测方法，其特征在于，步骤a中，10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间；步骤b中，加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。

4.如权利要求2或3所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB 的检测方法，其特征在于，步骤d中，溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

5.如权利要求2或3所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的检测方法，其特征在于，步骤a中，10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min；和/或，步骤b中，溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置
20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s；和/或，步骤d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。

说明书

技术领域

[0001] 本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种DNA-Ag NCs适体传感器的制备方法及对PDGF-BB的检测。

背景技术

[0002] 近年来，应用于临床诊断相关的蛋白质组学越来越重要，因此发展生物传感器用于检测与癌症相关的蛋白质十分有必要。血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)与多种疾病密切相关，如动脉硬化、纤维病，并且作为肿瘤血管发生指示剂在人类恶性肿瘤细胞中过度表达。因此开发高选择性、高灵敏性、低耗及无标记的生物传感器用于检测PDGF-BB至关重要。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法，应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。

[0004] 具体技术方案如下：

[0005] 一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，包括如下步骤：

[0006] (1)DNA探针加热一定时间后自然冷却并培养一段时间；

[0007] (2)DNA溶液加入AgNO3后振荡；

[0008] (3)黑暗中放置一段时间；

[0009] (4)溶液中加入NaBH4，振荡，黑暗中放置；

[0010] (5)得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

[0011] 进一步地，步骤(1)中，10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养50分钟。

[0012] 进一步地，步骤(2)中DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡30秒，步骤(3)中黑暗中放置20 分钟。

[0013] 进一步地，步骤(4)中溶液中加入NaBH4，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1-2小时。

[0014] 一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，采用上述的方法制备得到。

[0015] 上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的用途，用于无标记检测血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)。

[0016] 上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，包括如下步骤：

[0017] a、Apt-G4探针加热数分钟后自然冷却培养一段时间；

[0018] b、步骤a得到溶液加入一定浓度AgNO3并振荡；

[0019] c、步骤b得到溶液黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并振荡；

[0020] d、步骤c中溶液加入不同浓度的PDGF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

[0021] 步骤a中，10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间；步骤b中，加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。

[0022] 步骤d中，溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

[0023] 进一步地，步骤a中，10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min；和/或，步骤b中，溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s；和/或，步骤d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。

[0024] 与目前现有技术相比，本发明制备DNA-Ag NCs方法与已有技术相比，具有重现性高，耗能低，制备时间短且易控制等优点。以此无标记的适体传感器检测PDGF-BB，线性范围宽，检测限低，且本传感器选择性佳，灵敏度高。

实施方案

[0035] 下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

[0036] 针对现有技术以检测PDGF-BB的不足(需标记信号分子、特异性不足)，本实施例提供一种无标记的DNA-Ag NCs生物传感器的制备及其应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，得到的DNA-Ag NCs可用于适体传感器的构建，实现对PDGF-BB高选择性，高灵敏性的检测。

[0037] 实施例一：

[0038] 一种基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB，步骤如下：

[0039] a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min。

[0040] b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s。

[0041] c、(b)中溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。

[0042] DNA-Ag NCs的制备：10μM DNA探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。然后此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1小时，得到具有荧光的DNA-Ag NCs。

[0043] 实施例二：

[0044] 基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

[0045] a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。

[0046] b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30秒。

[0047] c、(b)中溶液黑暗中放置50分钟后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0小时。

[0048] 实施例三：

[0049] 一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

[0050] 基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

[0051] a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

[0052] b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。

[0053] c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mMK+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

[0054] 实施例四：

[0055] 以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，此DNA-Ag NCs具有光稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜在应用价值。通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。

[0056] 一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：

[0057] 10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

[0058] 基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

[0059] a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

[0060] b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。

[0061] c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

[0062] 实施例五：

[0063] 一种荧光性DNA-Ag NCs，以DNA为模板，利用化学还原法制得。一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

[0064] 基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

[0065] a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

[0066] b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。

[0067] c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

[0068] 所制得的DNA-Ag NCs的形貌如图2所示，Ag纳米粒子均匀，分散。

[0069] 取200μL DNA-Ag NCs溶液于石英比色皿中，检测波长段450nm-750nm间吸收峰，所得吸收光谱如图3A所示。取200μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其580nm激发处的发射光谱，所得光谱如图3B所示。取500μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其荧光寿命，所得荧光寿命图如图3C所示，从图中可以看出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs的荧光寿命减小，发生了电子的转移。取50mM磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液放入电解槽中，将制备的DNA-Ag NCs滴于工作电极上，检测其循环伏安曲线，从得到的CV图(图3D)可以看出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs发生了电子的转移。

[0070] 上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

附图说明

[0025] 图1为基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB示意图；

[0026] 图2为合成的DNA-Ag NCs的SEM图；

[0027] 图3(A)中,aDNA-Ag NCs紫外吸收光谱；b存在PDGF-BB及hemin时紫外吸收光谱；

[0028] 图3(B)DNA-Ag NCs激发a及发射光谱b-e；

[0029] 图3(C)中a为DNA-Ag NCs荧光寿命；b为存在PDGF-BB及hemin时荧光寿命；

[0030] 图3(D)DNA-Ag NCs在PDGF-BB及hemin存在时的循环伏安图；

[0031] 图4(A)不同浓度PDGF-BB对应荧光光谱；

[0032] 图4(B)荧光强度与不同PDGF-BB浓度对数间线性关系；

[0033] 图5为基于DNA-Ag NCs适体传感器的选择性考察；

[0034] 图6为基于DNA-Ag NCs适体传感器的重复性考察。

1一种生物适配体传感器的制备方法 2一种表面等离激元共振生物传感器 3荧光生物传感器，其制备方法及其用途 4一种微生物生化需氧量的测定传感器制备方法 5一种DNA生物传感器及其制备方法和应用 6一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 7一种荧光生物传感器，其制备方法以及用途 8一种旋臂式设施作物生物量多传感检测装置及方法 9一种电化学生物传感器，及其制备方法和用途 10一种超亲水的场效应管生物传感器及其制备方法