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基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2016-11-28

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2017-04-19

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2018-11-30

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2036-11-28

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201611062398.7	申请日	2016-11-28
公开/公告号	CN106525940B	公开/公告日	2018-11-30
授权日	2018-11-30	预估到期日	2036-11-28
申请年	2016年	公开/公告年	2018年
缴费截止日
分类号	G01N27/327	主分类号	G01N27/327
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	3
权利要求数量	4	非专利引证数量	1
引用专利数量	3	被引证专利数量	0
非专利引证	1、全文. Guangpeng Liu等.Impedimetric DNA-Based Biosensor for Silver Ions Detectionwith Hemin/G-Quadruplex Nanowire asEnhancer《.Electroanalysis》.2014,第26卷第2732-2738页.;
引用专利	CN104789674A、CN104833712A、CN104726560A	被引证专利
专利权维持	4	专利申请国编码	CN
专利事件	转让	事务标签	公开、实质审查、授权、权利转移

申请人信息

申请人	江南大学	第一申请人	江南大学
专利权人	江南大学	当前专利权人	安徽省华腾农业科技有限公司
发明人	周楠迪、孙笑凡、王淑玲、田亚平	第一发明人	周楠迪
地址	江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院	邮编	214122
申请人数量	1	发明人数量	4
申请人所在省	江苏省	申请人所在市	江苏省无锡市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

无锡市大为专利商标事务所

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

时旭丹、张仕婷

摘要

基于G‑四链体‑血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，属于分析化学技术领域。本发明设计了捕获探针和辅助探针，辅助探针两端均含能与目标DNA互补的核酸序列，而中间含有能形成G‑四链体的碱基序列。捕获探针与目标DNA相互识别，发生连续的聚合链式反应，形成链状聚集体，并被金电极表面的捕获探针固定至电极，在电极表面引入大量G‑四链体结构。随后G‑四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物，通过差分脉冲伏安法（DPV）扫描得到的电化学信号与电极表面的G‑四链体‑血红素复合物，以及体系中加入的目标DNA浓度存在对应关系，实现对目标DNA的检测。用该方法对样品中的HIV DNA进行检测，取得了理想的效果。本发明方法具有灵敏度高、特异性强的优点。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3
说明书附图：图4
说明书附图：图5
说明书附图：图6

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2020-12-11	专利权的转移	登记生效日: 2020.11.30 专利权人由江南大学变更为安徽省华腾农业科技有限公司地址由214122 江苏省无锡市无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院变更为234099 安徽省宿州市灵璧县灵城镇花园井居委会333
2	2018-11-30	授权
3	2017-04-19	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 27/327 专利申请号: 201611062398.7 申请日: 2016.11.28
4	2017-03-22	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其将捕获探针固定到金电极上，然后将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交，电化学法检测响应电流值；具体步骤如下：
（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4V至+1.5V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的CV图为止；将处理后的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；
（2）捕获探针的固定：将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；
将捕获探针用PBS缓冲液稀释；将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤（1）处理所得金电极上，使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭金电极
4h，得到修饰有捕获探针的金电极；用超纯水淋洗电极，氮气吹干待用；
（3）捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交：将步骤（2）所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2h；所述反应体系为：0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液；
（4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在电极上，室温下放置30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；
（5）电化学检测：
a、电化学反应：采用三电极系统，步骤（4）所得金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为含pH 7.4、20 mM KCl的20 mM HEPES缓冲液，检测前先通入氮气30 min；
b、标准曲线的绘制：检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（4）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线；
c、检测：对于未知浓度目标DNA样品，按上述步骤（1）-（4）同样操作后对其进行检测，测得峰电流后从标准曲线可读出其浓度值；
其特征在于：所述辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G-四链体的碱基序列，具体为
5’-目标序列后11个碱基的互补序列+ TTTGGGTAGG GCGGGTTGGG CT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’；
所述捕获探针具体为5’-HS-（CH2）6-TT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’。

2.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目
2+
标DNA浓度的电化学方法，其特征在于：所述PBS缓冲液中含有1mM Mg 、1M NaCl，其pH为
7.4。

3.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其特征在于：所述G-四链体形成液为每10 mM HEPES缓冲液中含有50mM KCl，其pH为8.0。

4.权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法的应用，其特征在于：对HIV DNA样品的浓度进行了检测，以HIV基因片段作为目标DNA，其序列为：
5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’ ；
相应的，设计其捕获探针序列为：5’- HS-(CH2)6-TTTAGTACTG GTG -3’；
设计辅助探针序列为：
5’-AAATTGCTGC CTTTGGGTAG GGCGGGTTGG GCTTAGTACT GGTG -3’；其中斜体部分表示可以形成G-四链体的碱基。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

[0002] 对特定的基因序列进行检测在临床诊断、疾病的预防和治疗、环境检测、食品安全检测等方面有十分重要的意义。传统的DNA检测方法存在一定的缺点，如操作繁琐、可能导致放射性污染、需要昂贵的检测仪器、灵敏度不高等。电化学DNA生物传感技术与传统的基因检测技术相比，具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、环境友好、可便携性好、不污染破坏检测样品等优势。上述的这些优势使得电化学DNA生物传感技术逐渐成为DNA序列检测方面的热门技术方法。

[0003] 研究新型电化学DNA生物传感器，开发出灵敏度高、特异性强、检测限低的特定基因序列的检测方法在医学检测、食品工业、环境监测等诸多领域具有重要意义和广泛的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的是将DNA杂交技术，信号放大技术与生物传感技术相结合，用G-四链体-血红素复合物作为信号标记，通过聚合链式进行信号放大，建立了一种灵敏度高、特异性强的针对单链目标DNA的检测方法。

[0005] 本发明的技术方案，一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其设计了两个特殊的DNA序列：捕获探针和辅助探针。特殊设计的辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G-四链体的碱基序列。将捕获探针固定到金电极表面。当体系中加入目标DNA时，捕获探针与目标DNA相互识别，由于辅助探针5’端序列能和目标DNA的 5’端序列反向互补，3’端序列能与目标DNA的3’端序列反向互补，中间部分能够折叠形成G-四链体，因而目标DNA 能与辅助探针发生按1:1的分子比发生连续的聚合链式反应，从而在电极表面引入大量G-四链体结构。在有血红素存在时，G-四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物从而提供检测信号。测得的电化学信号与目标DNA浓度存在对应关系，从而实现对目标DNA的定量灵敏检测。该方法在实际样品中也能对目标DNA进行了灵敏检测。具体原理如图1。

[0006] 首先将捕获探针固定到金电极上；将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交作用，包括：目标DNA的一部分序列和捕获探针发生杂交反应形成双链，另一部分序列与辅助探针发生杂交形成双链；由于辅助探针两端均含有能与目标DNA两端互补配对的核酸序列，通过目标DNA与辅助探针发生连续的聚合链式反应，借助辅助探针中间的G-四链体形成序列，在电极上引入大量的G-四链体结构；在血红素存在时形成G-四链体-血红素复合物；电化学法检测响应电流值。

[0007] 捕获探针序列与目标DNA的3’端反向互补，并且5’端带有巯基用于固定至金电极。辅助探针由三部分组成：5’端序列能和目标DNA的 5’端序列反向互补，3’端序列能与目标DNA的3’端序列反向互补，中间部分能够折叠形成G-四链体。

[0008] 具体步骤如下：

[0009] （1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4V至+1.5V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的CV图为止；将处理后的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；

[0010] （2）捕获探针的固定：将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将捕获探针用PBS缓冲液稀释；将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤（1）处理所得金电极上，使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭金电极4h，得到修饰有捕获探针的电极；用清洗缓冲液淋洗电极，氮气吹干待用；

[0011] （3）捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交：将步骤（2）所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2h；所述反应体系为：0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液；

[0012] （4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在电极上，室温下放置30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；

[0013] （5）电化学检测：

[0014] a、电化学反应：采用三电极系统，步骤（4）所得金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为含pH 7.4、20 mM KCl的20 mM HEPES缓冲液，检测前先通入氮气30 min；

[0015] b、标准曲线的绘制：检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线；

[0016] c、检测：对于未知浓度目标DNA样品，按上述步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，测得峰电流后从标准曲线可读出其浓度值。

[0017] 所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，所述辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G-四链体的碱基序列，具体为

[0018] 5’-目标序列后11个碱基的互补序列+ TTTGGGTAGG GCGGGTTGGG CT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’；

[0019] 所述捕获探针具体为5’-HS-（CH2）6-TT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’。

[0020] 所述PBS缓冲液中含有1mM Mg2+、1M NaCl，其pH为7.4。

[0021] 所述G-四链体形成液为每10 mM HEPES缓冲液中含有50mM KCl，其pH为8.0。

[0022] 对HIV DNA样品的浓度进行了检测，以HIV基因片段作为目标DNA，其序列为：

[0023] 5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’ ；

[0024] 相应的，设计其捕获探针序列为：5’- HS-(CH2)6-TTTAGTACTG GTG -3’；

[0025] 设计辅助探针序列为：

[0026] 5’-AAATTGCTGC CTTTGGGTAG GGCGGGTTGG GCTTAGTACT GGTG -3’；其中斜体部分表示可以形成G-四链体的碱基。

[0027] 本发明的有益效果：本发明构建了一种灵敏度高、特异性强的电化学DNA生物传感器，实现了对特定目标DNA的高灵敏检测；将电化学检测跟信号放大技术联合起来，提高检测灵敏度。

实施方案

[0034] 实施例1 基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测HIV DNA浓度。

[0035] HIV基因的携带者不一定都患有艾滋病，该基因发生突变将导致人的免疫系统被破坏，从而引发疫病。以突变位点所在的基因片段为检测目标序列开发出灵敏的检测方法对于艾滋病的早期筛查具有十分重要的意义。

[0036] 以HIV基因片段作为目标DNA，检测步骤同上所述。

[0037] 目标DNA序列为：5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’。

[0038] 设计捕获探针序列为：5’-HS-(CH2)6- TTTAGTACTG GTG -3’，探针的5’-端修饰巯基用以自组装至金电极表面上。

[0039] 设计辅助探针序列为：5’- AAATTGCTGC CTTTGGGTAG GGCGGGTTGG GCTTAGTACT GGTG -3’ ；其中斜体部分表示可以形成G-四链体的碱基。

[0040] 其中，捕获探针与目标HIV DNA的3’端的一半序列反向互补。而辅助探针的5’端序列能和目标DNA的 5’端的一半序列反向互补，3’端序列能与目标DNA的3’端的一半序列反向互补，辅助探针的中间部分序列能够折叠形成G-四链体（斜体部分）。

[0041] （1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4V至+1.5V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的CV图为止；将金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；

[0042] （2）捕获探针的固定：将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将捕获探针用PBS缓冲液稀释；将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤（1）处理所得金电极上，使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭金电极4h，得到修饰有捕获探针的金电极；用超纯水淋洗电极，氮气吹干待用；

[0043] （3）捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交：将步骤（2）所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2h；所述反应体系为：0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液；

[0044] （4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在电极上，室温下放置30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；

[0045] 经捕获探针固定至电极、捕获探针与目标DNA以及辅助探针之间的杂交及G-四链体-血红素复合物形成后所得到电极为工作电极，用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测；取一系列不同浓度的目标HIV DNA，以上述步骤（1）-（4）同样的操作和试剂进行反应后，测定在不同浓度目标DNA条件下进行聚合链式反应后的DPV曲线图（如图2所示）。

[0046] 分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（如图3所示）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10 fM到10 pM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=1.89992+0.21622logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/1e-7A)，线性相关系数0.99677。该方法对HIV DNA检测限达到9 fM。

[0047] 实施例2 对HIV DNA检测的特异性分析

[0048] 以上述HIV基因片段为例，用发生单碱基错配和三碱基错配的单链DNA取代原目标DNA参与杂交反应，具体步骤同实施例1。

[0049] 目标DNA序列为：5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’

[0050] 单碱基错配序列为：5’- GGCAGCAATT TGACCAGTAC TA -3’

[0051] 三碱基错配序列为：5’- GGCAGCAATT AGTCCAGTAC TA -3’（错配碱基均用斜体表示）

[0052] 比较目标DNA、单碱基错配DNA、三碱基错配DNA三种不同DNA存在下的信号响应。如图4所示，相比较于未错配的目标DNA产生的信号增加(A)，单碱基(B)和三碱基错配(C)产生的信号强度要低得多，从而验证了构建的电化学DNA生物传感器能很好地分辨目标DNA和突变序列。

[0053] 实施例3 电化学DNA生物传感器在实际样品中对目标HIV DNA进行检测[0054] 仍然以上述HIV基因片段为目标，在实际样品人血清中对一系列不同浓度的目标HIV DNA进行检测，具体步骤同实施例1。

[0055] 往人血清样品中分别添加一定浓度的HIV DNA，得到一系列不同浓度的目标DNA的血清样品，以步骤（1）-（4）同样的操作和试剂进行反应后，测定在不同浓度目标DNA条件下的DPV曲线图（如图5所示）。分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（如图6所示）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10 fM到10 pM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=1.53361+0.195logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/1e-7A)，线性相关系数
0.99219。目标DNA检测限达到9.8 f M。主要检测参数在水溶液中和血清样品中基本一致，说明该方法能够用于血清样品中单链目标DNA的测定。

附图说明

[0028] 图1：基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应的电化学检测单链DNA原理图。

[0029] 图2：不同浓度的HIV DNA存在下的DPV曲线。

[0030] 图3：DPV曲线中峰电流值与HIV DNA浓度关系标准曲线。

[0031] 图4：目标DNA和不同碱基错配DNA存在时峰电流变化直方图。

[0032] 图5：在血清样品中含有不同浓度的HIV DNA时的DPV曲线。

[0033] 图6：在血清样品检测中DPV曲线峰电流值与HIV DNA浓度关系标准曲线。

1一种可将样品快速固化成型的钢桥沥青路面剪切疲劳度检测装置 2一种测量水汽变温吸收光谱的系统及其使用方法 3地磅无人值守装置 4一种长管道的热除污机器人及其除污方法 5高精度智能酸度计及其测量方法 6一种高强度结构陶瓷加工用耐磨性能检测设备 7一种环保检测专用的污水水质检验仪 8一种便携式地质勘探用浅层取样钻机 9一种透明瓶装液体的杂质识别装置 10一种木头用除虫罐检测装置