[0027] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。
[0028] 实施例1
[0029] 菌株CS07的采集及培养
[0030] 样品采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，采集后冰盒保存，并迅速运回实验室进行石油降解微生物的富集分离。
[0031] 称取约10g新采集的沉积物样品加入到含100 mL富集培养基中的250 mL三角瓶中，在15℃静置培养条件下富集1周，然后以梯度稀释分离法分离获得石油降解菌株。
[0032] 培养基：
[0033] 无机盐培养基：MgS04·7H2O 0.7g， NH4NO3 1g， KCl 0.7g， KH2PO4 2g， Na2HPO4 3g，天然海水1000mL，pH7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。
[0034] 微量元素混合液：CaCl2 2mg， FeCl3·6H2O 50mg， CuSO4 0.5mg， MnCl2·4H2O 0.5mg， ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000mL。
[0035] 富集培养基：在上述无机盐培养基中，添加石油作为唯一碳源，碳源的添加量为：石油按培养基总量的0.5%（v/v）添加。
[0036] 分离培养基：在富集培养基中添加1.5%的琼脂凝固剂。
[0037] 实施例2
[0038] 菌株的形态观察及鉴定：
[0039] 将菌株CS07分别在以石油为唯一碳源的富集培养基和LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态。同时挑取菌落至2.5%戊二醛溶液固定1-2h，然后将菌悬液滴于硅片上，自然晾至微湿半干状态，再用pH为7.2的磷酸缓冲液冲洗硅片10min，冲洗3次后，分别用30%，50%，70%，85%，95%，100%乙醇梯度脱水，再向硅片滴加醋酸异戊酯进行固定，放置过夜。第二天将制备好的样品进行镀膜后，进行扫描电子显微镜观察。
如图1所示，菌株CS07在固体LB培养基上，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。如图2所示，菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm。
[0040] 根据菌株形态和培养特征排除重复菌株，然后将获得的菌株进行16SrRNA 基因序列分析。采用微波法提取分离获得的微生物基因组DNA，以细菌通用引物F27: 5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'，R1492: 5'-TACCTTGTTACGAC TT-3'（上海生工合成），进行PCR扩增，PCR扩增产物的测序结果提交到NCBI的GeneBank数据库进行比对分析，并利用Blast软件和MEGA软件构建获得的微生物菌株系统发育树，进行可培养微生物种群多样性分析。如图3所示为菌株CS0716SrRNA序列分析，结合其形态结构观察，鉴定菌株CS07为Marinobacter maritimus。
[0041] 实施例3
[0042] 菌株CS07石油降解性能的测定
[0043] 菌株CS07石油降解性能评价采用气相色谱法（日本岛津）测定各菌株的石油降解率。以萃取出的石油醚混合物为样品，使用GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪对菌株降解前后的石油含量变化进行分析。色谱柱型号为HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm），进样量为1μL。菌株的对石油的降解率计算公式为：η=（n0-n1）/n0×100%，其中，η为石油降解率，n0为空白对照，n1为接种了菌株的培养液的萃取液中残余的石油含量。
[0044] 在富集培养基加入150μL石油做为唯一碳源进行各菌株石油降解性能分析。将菌株（菌悬液浓度为108cfu/ml）按照1%的接种量接种至含100ml富集培养基中，分别在15℃静置和150r/min摇床振荡和28℃摇床振荡培养7d后，以30ml石油醚进行萃取，采用GC-MS法测定萃取液中石油烃各组分的降解情况。同时分别观察培养温度（15℃和28℃），pH值（pH5-9），NaCl浓度（0-9%）对菌株CS07降解功能的影响。GC-MS分析时，采用石油醚萃取发酵液，以萃取的石油醚混合物为样品。以未加微生物菌株的富集培养基作为对照，实验重复3次。
[0045] GC-MS分析石油的色谱条件为：进样口温度为200℃；载气为氦气，柱箱初始温度为40℃，升温程序设定为40℃保持5min，之后以10.00℃/min的速度升温至230℃，保持17min；
离子源温度为230℃，扫描范围为50-600amu。
[0046] 在28℃摇床培养条件下，菌株CS07降解率最高，7d石油降解率可达到28.55%；15℃摇床培养条件下，菌株CS07降解率稍低，7d降解率为23.54%；在15℃静置培养条件下，菌株CS07的降解率最低，7d降解率仅为5.73%（表1），说明菌株CS07在中温振荡培养时其降解能力明显好于低温静置培养，氧气在石油的降解中十分必要。但菌株CS07的石油降解率明显不高，
[0047] 在15℃摇床培养7d，pH=7时，菌株CS07的降解率达到最大值（24.92%）。在NaCl浓度为3%时，菌株CS07的降解率达到最大值，此时菌株CS07的在15℃摇床培养条件下7d的石油降解率为25.69%，之后，随着NaCl浓度的升高，菌株CS07的降解率降低，在NaCl浓度为9%时，菌株CS07已不能降解石油。
[0048] 实施例4
[0049] 菌株CS07石油凝聚性能的测定
[0050] 在降解菌株筛选的过程中，观察到菌株CS07在降解石油的同时，会使石油出现凝聚成球状物质的现象，同时发酵液呈现澄清状态，如图4所示为菌株CS07对石油的凝聚现象照片。其中图4-1是加入石油未接种菌株CS07的发酵液对照；图4-2是接入菌株CS07的发酵液中石油凝聚呈颗粒状，发酵液变清澈。由图4可知，菌株CS07对石油具有一定的凝聚性能，因此，对其性能进行更深入研究。
[0051] 在100ml富集培养基加入150μL石油做为唯一碳源，然后将菌株CS07（菌悬液浓度为108cfu/ml）以1%的接种量接种至含100ml富集培养基中，在15℃振荡（150rpm/min）培养7d，观察菌株CS07凝聚性能。
[0052] 采用LB液体培养基振荡培养菌株CS07，使菌株生长至对数期，然后向发酵液中加入石油观察石油的凝聚情况。同时，将培养好的发酵液离心，分别收集上清液和沉淀。对上清液和沉淀的观察如下：（1）向上清液中加入石油观察石油的凝聚情况。（2）向沉淀中加入灭菌的ASM培养基，摇匀后加入石油，观察石油的凝聚情况，同时以ASM培养基作为对照。
[0053] 如图5所示，其中，a为LB发酵原液对石油的凝聚作用；b为LB发酵液离心后的上清液对石油的凝聚作用；c为LB发酵液离心后的沉淀（即菌体）+ASM培养基混匀后对石油的凝聚作用。石油在发酵液原液、上清液及沉淀的ASM培养基溶液中都发生了凝聚，而对照培养基ASM则没有发生凝聚（图4-1），石油呈膜状漂浮于ASM培养基表面。
[0054] 经不同处理后石油凝聚现象也各不相同。振荡培养时，石油均发生了较明显凝聚现象，但低温振荡凝聚现象更为明显，发酵液在3d后就开始变为澄清溶液，石油明显的聚集呈颗粒状。
[0055]
[0056] 注：+为凝聚现象不明显，石油呈片块状；++为凝聚现象较明显，石油部分呈颗粒状；+++为凝聚现象很明显，石油全部呈颗粒状，溶液变为澄清。
[0057] 实验结果：
[0058] 通过对菌株CS07在不同培养条件下的降解性能评价以及凝聚情况评价，发现菌株CS07在28℃摇床培养条件下降解率最高，但在15℃摇床培养条件下凝聚情况最好，在15℃静置培养条件下，菌株CS07对石油的降解率极低，并且凝聚情况最差。通过GC-MS分析，可知菌株CS07对石油烃中的全组分都可以降解，但在不同条件下降解的组分不同，在28℃摇床培养时，菌株CS07主要降解长链烷烃，因此降解后的石油组分中短链烷烃甚至出现了增加的情况，在15℃培养条件下，石油中各组分都呈现下降的状态，但相比而言菌株CS07在15℃摇床培养的条件下，对石油中各组分的降解较为均衡，在15℃静置培养条件下，石油中短链烷烃的部分降解率较高，而长链烷烃的部分降解率较低。
