[0018] 下面结合具体实施例并参照数据对本发明进行详细说明。本发明所列实施例只是为了举例说明本发明,并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0019] 在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般均为本领域普通技术人员常理解的含义。无特殊说明,所使用材料、试剂等均为常规市售。未详细描述的各过程和方法均为本领域公知的常规方法。
[0020] 实施例1:18F-SFB-CML的合成
[0021] 向盛有18F离子的容器中加入SFB(10mg SFB,1mL乙腈溶解),90℃反应7min,反应结束后冷却至室温。然后加入6mL 0.1M的HCl,通气搅拌1min,反应液通过C18柱(使用之前用7.5mL 0.1M的HCl和2.5mL乙腈的混合液冲洗)至废液瓶。再加入3mL乙腈流经C18柱,将中间产物洗脱至2号反应管(预先加入40μL的四丙基氢氧化铵TPAOH)。
[0022] 加热干燥除乙腈,然后加入TSTU溶液(将10mg TSTU即2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯溶于1mL的乙腈中),90℃反应7min,反应结束后冷却至室温。加入5mL0.1M的HCl,通气搅拌1min,反应液通过C18柱(使用前先用10mL甲醇冲洗,再用20mL的灭菌注射用水冲洗)至废液瓶,加入1mL乙腈至经C18柱,将产品洗脱出来即为18F-SFB。
[0023] 取300μL的CML(3mg CML溶于0.01M pH=8.5碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液)于EP管中,再加入50μL的SFB,加入25μL的0.1M Na2CO3溶液,调节pH至8.5左右,65℃反应20min,反应完成后冷却至室温备用。
[0024] 将产物通过HPLC进行分离纯化,获得最终产物18F-SFB-CML。
[0025] 对得到的最终产物18F-SFB-CML,外观、性状、pH值及结构确证,用19F-SFB-CML作为标准对照品(没有放射性),采用完全相同的色谱方法进行HPLC检测,确证18F-SFB-CML的结构,委托中国药科大学分析测试中心进行结构确证。
[0026] 其中,19F-SFB-CML标准品的合成步骤如下:
[0027] 取预先溶解好的1mg/mL CML(羧甲基赖氨酸复合物)的碳酸缓冲溶液(pH=9)25μL至反应管,再加入预先用乙腈溶解的[19F]-SFB(N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯)溶液(1mg/mL)25μL,然后将反应管置于油浴锅中,65℃反应1h,期间用薄层色谱板监控反应结束后,取出反应液加入到半制备型高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化,收集目标产物19F-SFB-CML。并通过质谱及核磁进行结构确证,再通过分析型高效液相色谱法(HPLC)检测其化学纯度。
[0028] 合成获得的19F-SFB-CML标准品,委托中国药科大学分析测试中心进行结构确证。测试结果证实,标准品结构确证为19F-SFB-CML结构;并通过质谱和核磁共振检测谱图证实所得标准品的确证为19F-SFB-CML。
[0029] 进一步采用分析型高效液相色谱法(HPLC),检测其19F-SFB-CML标准品化学纯度大于99%。
[0030] 通过HPLC检测,证实了所得产物确实为18F-SFB-CML,其放射性化学纯度为97.44%;放射性活度浓度不低于370MBq/mL;放射性比活度为1.651Ci/μmol或61.09GBq/μmol。
[0031] 进一步的,对产物18F-SFB-CML的稳定性进行了测定,试验结果显示,本实施例制备的18F-SFB-CML在第4h时的放射性化学纯度为97.33%,由此证明18F-SFB-CML在体外溶媒中4h内稳定性较好,未发现有脱氟显像。
[0032] 本实施例合成的分子探针18F-SFB-CML,放射化学纯度高,在体内稳定,不容易被降解,具有足够长的衰减时间来进行成像。
[0033] 实施例2:ApoE-/-小鼠micro PET扫描
[0034] (1)血管钙化动物模型的构建
[0035] 本实验所用雄性apoE-/-小鼠均来源于江苏大学实验动物中心。饲喂条件:温度22±2℃,湿度40-60%,12小时循环照明,普通饮食,自由摄取食、水。所有进入SPF房中的物品都须经过高温高压消毒,实行严格的无菌操作。6周龄时,实验组小鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,溶于0.05mol/L pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中)40mg/kg/day,连续5天。2周后血糖水平>300mg/dL的小鼠纳入本研究,连续普通饮食饲喂24个月。
[0036] (2)18F-SFB-CML micro PET显像
[0037] 扫描前称重,异氟烷/氧气混合气体麻醉(1.5-2.0%),尾静脉注射18F-SFB-CML(注射剂量7.4MBq,注射体积150μL),进行动态扫描1h点并在注射后2h进行Micro PET动态扫描10min。扫描结束对小鼠行安乐死并分离主动脉,进行主动脉离体micro PET扫描。扫描层厚:0.78mm,矩阵:128*128,采集时间10min,采集能窗350-650kev。扫描采集结束后,将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建,迭代2次,重建后利用西门子扫描仪自带分析软件分析。
[0038] (3)标本的采集与vonKossa染色
[0039] 暴露小鼠心脏后,分离自主动脉根至髂总分支的动脉全长,除去外膜结缔组织与脂肪组织。PBS灌洗后固定、常规脱腊、梯度脱水后按vonKossa钙染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作:石蜡切片置于2%硝酸银溶液中,强阳光下直射40min后用蒸馏水冲洗3遍,吸净蒸馏水后用5%硫代硫酸钠溶液定影处理2min,再次用蒸馏水冲洗3min,中性品红复染3min,经梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片后,于光镜下观察动脉钙盐沉积及分布情况。
[0040] (4)18F-SFB-CML对血管钙化的示踪和病理验证
[0041] 由microPET扫描(图1)可见,静脉注射显像剂5min后,模型组与对照组小鼠的心血管系统都有18F-SFB-CML的富集,且在15min内模型组小鼠显影剂在心血管系统的富集要低于对照组小鼠。但25min后对照组的显像剂开始迅速排泄至膀胱,而模型组的心脏和血管系统排泄很缓慢,即使到了55min时仍有大量的显像剂富集在主动脉及其分支系统,尤其是颈动脉和胸主动脉。这在2h静态microPET/CT扫描中显示的非常清晰(图2)。
[0042] 进一步的对比18F-SFB-CML和18F-NaF,发现在同一只糖尿病血管钙化模型小鼠,静脉用药2h后18F-SFB-CML在颈动脉和胸主动脉的富集特异性要远高于18F-NaF,且18F-NaF由于不仅能显示钙盐沉积也能显示骨盐,所以脊柱中富集的18F-NaF强显影及其伪影远远超过了钙化血管壁的显像,使得通过18F-NaF显影来识别血管钙化变得非常困难。
[0043] 另外,对显像剂不同富集程度动脉节段的vonKossa钙染色发现,18F-SFB-CML的富集程度能够比较准确的反映出血管壁钙化灶的分布和大小,但18F-NaF的富集与血管钙化病变分布并不能很好的吻合(图2)。
[0044] 图2为糖尿病血管钙化apoE-/-小鼠microPET/CT的2小时静态扫描与vonKossa钙18
染色病理学验证结果;左上图为 F-NaF microPET/CT三个层面(横断面、冠状面、矢状面)的扫描图,左下图为18F-SFB-CML microPET/CT三个层面(横断面、冠状面、矢状面)的扫描图,右图为该模型小鼠颈动脉、胸主动脉和腹主动脉的vonKossa钙染色(黑色为阳性染色区域)。
[0045] 实施例3:LDLR+/-仓鼠micro PET/CT扫描
[0046] 本实验所用雄性LDLR+/-仓鼠均来源于江苏大学实验动物中心。6周龄时,血管钙化组仓鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,溶于0.05mol/L pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中)40mg/kg/day,连续5天。2周后血糖水平>300mg/dL的小鼠纳入本研究,对照组为6周龄雄性LDLR+/-仓鼠连续普通饮食饲喂48个月。
[0047] 造模结束后通过异氟烷麻醉仓鼠,待其翻正反射消失,舌下静脉注射显影剂(每只200μci左右),固定至micro PET/CT扫描床,采集方式为2h静态多维度扫描。
[0048] 对比18F-SFB-CML和18F-NaF microPET/CT扫描结果,对照组仓鼠均看不到两种核素在心血管系统的富集,而模型组仓鼠则均可以看到心血管系统核素富集;但与18F-NaF核素在脊柱等骨的强富集和强伪影相比,18F-SFB-CML则比较特异的富集在心血管系统,尤其18
是颈动脉和胸主动脉。另外,对显像剂不同富集程度动脉节段的vonKossa钙染色发现,F-SFB-CML的富集程度能够比较准确的反映出血管壁钙化灶的分布和大小,但18F-NaF的富集与血管钙化病变分布并不能很好的吻合(图3)。
[0049] 图3为糖尿病血管钙化LDLR+/-仓鼠microPET/CT多维静态扫描与vonKossa钙染色18
病理学验证结果;左图为 F-SFB-CML microPET/CT三个层面(横断面、冠状面、矢状面)的扫描图,右图为18F-NaF microPET/CT三个层面(横断面、冠状面、矢状面)的扫描图,上边为对照组,下边为模型组。中间图为vonKossa钙染色病理学验证结果,分别为颈动脉vonKossa染色、胸主动脉vonKossa染色、腹主动脉vonKossa染色。从扫描结果及病理学染色验证结果可知18F-SFB-CML可有效示踪糖尿病仓鼠血管钙化,图中黑色为vonKossa染色阳性的钙盐沉积即血管壁钙化灶。