[0005] 本发明的目的是提供一种葡萄糖响应性药物控释载体的制备方法，采用一种能与羟基、氨基、巯基等多种官能团反应的二乙烯基砜将Con A与含糖单元的聚合物基体直接固定交联，通过反相乳液分散法形成具有葡萄糖响应性的药物控释微凝胶载体，解决了现有技术中葡萄糖响应性药物控释载体的制备中需要对Con A及其糖配体聚合物改性，工艺复杂的不足。
[0006] 本发明的所采用的技术方案为：一种葡萄糖响应性药物控释载体的制备方法，具体步骤如下：
[0007] 1）将含糖单元的聚合物溶解于碱液中并搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜进行反应，用1～5mol/L的酸液调节pH值至4-5以停止反应，反应后的溶液于去离子水中透析4～7天，得到带有乙烯基砜基团的含糖单元的聚合物；
[0008] 2）将上述制得的带有乙烯基砜基团的含糖单元的聚合物溶解于pH7.0-8.0的缓冲溶液中，加入Con A活化液搅拌均匀，室温下搅拌1-3h；
[0009] 3）混合环己烷与乳化稳定剂；将步骤2）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至8.0-10.0，之后立即滴加到环己烷与乳化稳定剂混合溶液中，搅拌，静置，之后去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0010] 步骤1）所述的含糖单元的聚合物包括分子量为40～100kDa的葡聚糖、分子量为400～700kDa的聚蔗糖、分子量为10～40kDa的聚葡萄糖氧乙基丙烯酸酯或分子量为10～
40kDa的聚葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯；所述的碱液为0.01～1mol/L的氢氧化钠、氢氧化钾；含糖聚合物溶于碱液中配成质量分数为1%～10%的溶液，搅拌速度为200～600rpm；
所述的酸为盐酸，硫酸，硝酸，磷酸；所述的二乙烯基砜与聚合物中羟基的摩尔比为0.5～
2.5:1；所述的加入二乙烯基砜后的反应条件为室温下以搅拌速度为200～600rpm搅拌
2～30min；所述的透析采用截留分子量为3-5kDa的透析膜。
[0011] 步骤2）中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或磷酸盐-柠檬酸缓冲液；所述的带有乙烯基砜基团的含糖单元的聚合物溶于缓冲溶液后初始浓度为5～25mg/mL；所述的带有乙烯基砜基团的含糖单元的聚合物与Con A的质量比为1～10:1。
[0012] 步骤2）中所述的Con A活化液制备方法如下：将Con A溶于含有0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/L MnCl2的pH7.0～7.8的缓冲溶液中，Con A初始浓度为1～10mg/mL，静置6h以上。
[0013] 上述所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或磷酸盐-柠檬酸缓冲液。
[0014] 步骤3）中所述的乳化稳定剂为吐温85，司班80，司班60；所述的环己烷与乳化稳定剂的体积质量比为26～160ml/g；所述的混合条件为以500～800rpm转速于室温下搅拌0.5-1h；所述的混合溶液滴加到环己烷与乳化稳定剂混合溶液中后以500～800rpm转速搅拌2～5h，之后静置1-2h。
[0015] 本发明的有益效果：将二乙烯基砜引入Con A-含糖聚合物载体的制备中可以大大简化载体的制备步骤，提高效率和降低成本。使用的交联剂二乙烯基砜能够与羟基、氨基、巯基等多种官能团反应，反应迅速，反应条件温和，不需要对聚合物基体以及Con A进行改性即可直接交联，也避免了Con A改性过程造成的原料损失以及可能造成的葡萄糖敏感性下降的损失，同时该方法固定Con A简单、高效，成本低，实施方便，利于大规模生产。具体实施方式：
[0016] 实施例1：
[0017] 1）将葡聚糖（分子量70kDa）溶解于0.01mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为10%的溶液，以300rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与葡聚糖中羟基的摩尔比为0.5:1，保持相同转速室温下反应10min后用1mol/L的盐酸调节pH值至5以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量5kDa）7天，经冷冻干燥得到取代度为20%（取代度通过核磁谱图计算得到）的带有乙烯基砜基团的葡聚糖。
[0018] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/L MnCl2的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，Con A初始浓度为5mg/mL，静置6h。
[0019] 3）将带有乙烯基砜基团的葡聚糖溶解于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，初始浓度为25mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为5:1，室温下搅拌1h。
[0020] 4）在圆底烧瓶中加入50mL环己烷并混合0.8g乳化稳定剂吐温85，以800rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至8.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌2h之后静置1h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0021] 实施例2：
[0022] 1）将葡聚糖（分子量100kDa）溶解于0.1mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为2%的溶液，以500rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与葡聚糖中羟基的摩尔比为1.25:1，保持相同转速室温下反应15min后用5mol/L的硫酸调节pH值至4以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量3kDa）7天，经冷冻干燥得到取代度为40%的带有乙烯基砜基团的葡聚糖。
[0023] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，Con A初始浓度为10mg/mL，静置6h。
[0024] 3）将带有乙烯基砜基团的葡聚糖溶解于pH7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，初始浓度为10mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为8:1，室温下搅拌1h。
[0025] 4）在圆底烧瓶中加入60mL环己烷并混合1.1g乳化稳定剂司班80，以800rpm转速于室温下搅拌1h；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至9.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌3h之后静置2h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0026] 实施例3：
[0027] 1）将葡聚糖（分子量40kDa）溶解于1mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为5%的溶液，以500rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与葡聚糖中羟基的摩尔比为2.5:1，保持相同转速室温下反应30min后用5mol/L的硝酸调节pH值至5以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量5kDa）7天，经冷冻干燥得到取代度为90%的带有乙烯基砜基团的葡聚糖。
[0028] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.4的磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中，Con A初始浓度为10mg/mL，静置6h。
[0029] 3）将带有乙烯基砜基团的葡聚糖溶解于pH7.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液中，初始浓度为20mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为1:1，室温下搅拌3h。
[0030] 4）在圆底烧瓶中加入80mL环己烷并混合1.5g乳化稳定剂司班60，以800rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至10.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌5h之后静置2h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0031] 实施例4：
[0032] 1）将聚蔗糖（分子量400kDa）溶解于0.01mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为2%的溶液，以600rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与聚合物中羟基的摩尔比为1.5:1，保持相同转速室温下反应20min后用1mol/L的磷酸调节pH值至5以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量5kDa）7天，经冷冻干燥得到取代度为25%的带有乙烯基砜基团的聚蔗糖。
[0033] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.8的磷酸盐缓冲溶液中，Con A初始浓度为2mg/mL，静置6h以上。
[0034] 3）将带有乙烯基砜基团的聚蔗糖溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，初始浓度为10mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为8:1，室温下搅拌1h。
[0035] 4）在圆底烧瓶中加入50mL环己烷并混合0.8g乳化稳定剂吐温85，以600rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至9.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌4h之后静置1h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0036] 实施例5：
[0037] 1）将聚葡萄糖氧乙基丙烯酸酯（分子量10kDa）溶解于0.01mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为1%的溶液，以300rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与聚葡萄糖氧乙基丙烯酸酯中羟基的摩尔比为1.5:1，保持相同转速室温下反应25min后用1mol/L的盐酸调节pH值至4以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量3kDa）7天，经冷冻干燥得到取代度为30%的带有乙烯基砜基团的聚葡萄糖氧乙基丙烯酸酯。
[0038] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，Con A初始浓度为10mg/mL，静置6h以上。
[0039] 3）将带有乙烯基砜基团的聚葡萄糖氧乙基丙烯酸酯溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，初始浓度为10mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为10:1，室温下搅拌1h。
[0040] 4）在圆底烧瓶中加入40mL环己烷并混合0.5g乳化稳定剂吐温85，以500rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至9.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌5h之后静置1h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0041] 实施例6：
[0042] 1）将聚葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯（分子量10kDa）溶解于0.01mol/L的氢氧化钾水溶液中配成质量分数为1%的溶液，以200rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与聚葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯中羟基的摩尔比为1.5:1，保持相同转速室温下反应30min后用1mol/L的盐酸调节pH值至5以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量3kDa）7天，经冷冻干燥或旋转蒸发得到取代度为30%的带有乙烯基砜基团的聚葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯。
[0043] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，Con A初始浓度为10mg/mL，静置6h以上。
[0044] 3）将带有乙烯基砜基团的聚葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，初始浓度为15mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为5:1，室温下搅拌1h。
[0045] 4）在圆底烧瓶中加入45mL环己烷并混合0.7g乳化稳定剂吐温85，以600rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至10.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌5h之后静置1h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
[0046] 实施例7：
[0047] 1）将聚蔗糖（分子量700kDa）溶解于0.01mol/L的氢氧化钠水溶液中配成质量分数为2%的溶液，以600rpm的转速搅拌均匀，之后加入二乙烯基砜，二乙烯基砜与聚合物中羟基的摩尔比为1.5:1，保持相同转速室温下反应2min后用1mol/L的盐酸调节pH值至5以停止反应。反应后的溶液于去离子水中透析（透析膜截留分子量4kDa）4天，经冷冻干燥得到取代度为5%的带有乙烯基砜基团的聚蔗糖。
[0048] 2）Con A活 化 液 制 备：将 Con A溶 于 含 有 0.1mol/L KCl,0.1mmol/L CaCl2,0.1mmol/LMnCl2的pH7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，Con A初始浓度为1mg/mL，静置6h以上。
[0049] 3）将带有乙烯基砜基团的聚蔗糖溶解于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，初始浓度为5mg/mL，加入Con A活化液搅拌均匀，带有乙烯基砜基团的含糖单元聚合物与Con A的质量比为6:1，室温下搅拌1h。
[0050] 4）在圆底烧瓶中加入40mL环己烷并混合1.5g乳化稳定剂吐温85，以600rpm转速于室温下搅拌30min；将步骤3）中得到的混合物缓冲溶液pH调节至10.0，之后立即用5#注射器针头缓慢滴加到烧瓶中，保持相同转速搅拌4h之后静置1h，去除上层油相，下层用异丙醇沉淀，离心、水洗3-5次，经冷冻干燥即得葡萄糖响应性微凝胶载体。
