[0028] 本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SL-7，保藏编号为GDMCC No:60630。本发明所述解淀粉芽孢杆菌SL-7的16S基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0029] 本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌SL-7在降解纤维素中的应用。
[0030] 本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌SL-7在解磷中的应用。
[0031] 本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌SL-7在制备降解烟草秸秆菌剂中的应用。
[0032] 本发明所述降解烟草秸秆菌剂的制备方法，优选包括以下步骤：将所述解淀粉芽孢杆菌SL-7接种于CMC发酵培养基中培养3d，得到降解烟草秸秆菌剂；所述CMC发酵培养基中以蛋白胨为唯一氮源、CMC—Na为唯一碳源，所述唯一碳源与唯一氮源的C/N比为2:1。本发明所述解淀粉芽孢杆菌SL-7的接种体积优选为所述CMC发酵培养基体积的6～10％，更优选为8％。本发明所述培养的温度优选为25～45℃，更优选为37℃。本发明所述培养的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0。本发明在所述培养过程中优选伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为180～200rpm，更优选为200rpm。本发明所述培养的时间优选为2d-4d，更优选为3d。
[0033] 本发明还提供了所述降解烟草秸秆菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。
[0034] 本发明所述烟草秸秆堆肥的制备方法，优选包括：将所述菌剂与烟草秸秆按照5:100的质量比混合均匀，并调节混合物的含水量为50～60％，开始堆肥。本发明在所述堆肥过程中，优选的自然通风，并且每日定时监测堆体温度，测温点位于堆体中部。待堆体温度升至70℃左右时，进入前腐熟阶段，优选的4～5d翻堆一次；至堆体温度降至50℃及以下时，每隔2d翻堆一次，至堆体温度降至40℃以下并不再上升时，停止翻堆。待堆体进入后腐熟阶段，每日定时监测堆体中碳元素和氨元素的质量比，当碳元素和氢元素的质量比小于20时，则表明后腐熟阶段完成，整个堆制过程也随之结束。本发明所述解淀粉芽孢杆菌SL-7够快速降解纤维素，并且具有此菌种具有解磷的能力，能够有效提高土壤中的磷含量。
[0035] 下面结合实施例对本发明提供的解淀粉芽孢杆菌SL-7及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0036] 实施例1
[0037] 从安徽境内烟叶产区采集烟草秸秆，自然晾干后剪碎成3～5cm长，用高速万能粉碎机粉碎，粉碎后的烟杆粉末过50目筛后，保存到自封袋中备用。
[0038] 称取1g烟杆样品到灭菌的试管中，然后加10mL灭菌的去离子水，置于恒温震荡培养箱中220rpm震荡浸取6～8h，震荡完成后取浸取液梯度稀释至10-1，10-2。
[0039] 用移液枪吸取200μL稀释后的烟杆样品浸提液，分别在细菌初筛培养基(烟草秸秆粉末10g/L，琼脂18g/L，自然pH值，121℃灭菌20min)上进行涂布培养，细菌初筛培养基放置在37℃恒温培养箱中进行培养。
[0040] 挑取在初筛培养基上长出的不同形态的细菌菌株到LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母菌膏5g/L，琼脂18g/L，NaCl 10g/L，自然pH值，121℃灭菌20min)上进行分离划线。将分离划线得到的单菌落转接到LB斜面培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母菌膏5g/L，琼脂18g/L，NaCl 10g/L，自然pH值，加热溶解后分装到斜面试管中高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，灭菌完成后适当冷却摆成斜面即可)上，在37℃培养3～5d保存在4℃冰箱中。
[0041] 另挑取分离出的细菌，37℃、220rpm在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母菌膏5g/L，NaCl 10g/L，自然pH值，121℃灭菌20min)中恒温震荡培养8～12h后加入一定量灭菌的甘油保存在-80℃冰箱中，甘油终浓度应在20～25％之间。
[0042] 实施例2
[0043] 对实施例1筛选出的多种菌进行纤维素降解能力测试：
[0044] 1、试验用培养基
[0045] (1)菌株纯化常用培养基
[0046] LB培养基、LB液体培养基；
[0047] (2)降解纤维素酶筛选培养基
[0048] 羧甲基纤维素钠培养基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.1，KH2PO40.5，CaCl20.1，K2HPO42，CMC-Na 10，(NH4)2SO42，琼脂18，pH 7.0～7.4；
[0049] 羧甲基纤维素酶活(CMCase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠1.5，CMC-Na 10，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0；
[0050] 滤纸酶活(FPase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠1.5，滤纸0.05，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0。
[0051] 2、主要试剂
[0052] 刚果红溶液(1mg/mL)：称取1g刚果红定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
[0053] 氯化钠溶液(1mol/L)：称取58.5g氯化钠定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
[0054] 缓冲溶液：配取50mL缓冲溶液以0.2mol/L醋酸钠溶液与0.2mol/L醋酸溶液分别量取35.2mL和14.8mL。
[0055] DNS试剂：称取6.3g 3,5—二硝基水杨酸，21.0g NaOH于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解，以及500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，最后定容至1000mL，装入棕色试剂瓶中，保存一星期稳定后备用。
[0056] 羧甲基纤维素钠底物溶液(0.5％)：5g羧甲基纤维素钠溶于1000mL缓冲溶液中，备用。
[0057] 滤纸底物溶液：在2mL缓冲溶液中加入0.03g滤纸。
[0058] 3、试验方法
[0059] (1)平板定性测定
[0060] 将单菌落分别点种在羧甲基纤维素钠培养基上，细菌27℃培养3d。用1mg/mL刚果红染色15min，倾去染液，再加入lmol/L的氯化钠溶液漂洗，15min后倒掉氯化钠溶液，测透明圈的直径与菌落直径：该株细菌可在CMC-Na培养基上生长，经刚果红染色后产生明显的纤维素降解圈，结果如图1所示，培养4d后降解圈直径与菌落直径的比值较大的细菌为解淀粉芽孢杆菌SL-7(7.52±0.35)。再以所述解淀粉芽孢杆菌SL-7去测定纤维素酶活。
[0061] (2)纤维素酶活的测定
[0062] DNS法测定葡萄糖吸光值，以OD530为横坐标、葡萄糖量(mg/mL)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y＝0.452x+0.016，R2＝0.9916。将抑菌率较高的菌株接种CMCase检测培养基及FPase检测培养基，于28℃、160r/min分别振荡培养1、2、3、4、5、6、7d，5000r/min离心10min，取上清液分别检测CMC酶活及FPase酶活。酶活力单位的定义：以每毫升发酵上清液酶促反应30min释放1μg葡萄糖的量为一个酶活单位(U)。
[0063] CMCase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 1％CMC-Na溶液(以0.2mol/LpH 4.8的乙酸缓冲液配制)中，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，充分混匀后50℃酶促反应30min，取出后迅速加入DNS试剂3mL，置于沸水浴显色10min，流水冷却至室温，再用去离子水定容至25mL，摇匀，用对照管调零，测定530nm吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的量。
[0064] FPase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 0.2mol/L pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并加入新华滤纸条(6cm×1cm)，滤纸条浸泡于液体中混匀，50℃酶促反应30min，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，DNS法测定还原糖生成量。
[0065] 结果如图2所示，该株细菌在CMCase和FPase培养基培养中，菌株SL-7发酵液上清液的CMCase和FPase均随着时间的增加呈先升后降的趋势，CMCase在第3d达到最高为84.81U/mL，FPase在第3d达到最高为35.40U/mL。
[0066] 实施例3
[0067] 对实施例2筛选得到的菌株SL-7进行解磷能力测试：
[0068] 1、培养基
[0069] (1)菌株纯化常用培养基
[0070] LB培养基、LB液体培养基；
[0071] (2)解磷效果测定培养基
[0072] 有机磷无机磷固体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5，NaCl0.3，KCl 0.3，K2SO40.3,MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O0.03，磷酸钙5.0，卵磷脂2.0，琼脂20.0，pH为7.0～7.5。
[0073] 有机磷液体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，CaCO35.0，卵磷脂2.0，pH为7.0～7.5。(实验时用新鲜蛋黄液代替卵磷脂，每50mL加入新鲜蛋黄液3mL，蛋黄液与0.9％的生理盐水等比例配制。)
[0074] 无机磷液体培养基(g/L)：葡萄糖10.0，(NH4)2SO40.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，Ca3(PO4)25，pH为7.0～7.5。
[0075] 2、主要试剂
[0076] (1)解磷效果测定所需试剂
[0077] 酒石酸锑钾溶液(0.5％)：称取0.5g酒石酸锑钾固体加入到100mL蒸馏水中，搅拌，混匀即可。
[0078] 钼锑抗贮存液：浓硫酸153mL缓慢地倒入置有约400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌，冷却。10g钼酸铵溶解于约60℃的300mL蒸馏水中，冷却。然后将浓硫酸溶液倒入钼酸铵溶液中，再加入100mL0.5％酒石酸锑钾(KSB，C4H4O6·1/2H2O)溶液，最后用蒸馏水定容至1L，避光保存。
[0079] 钼锑抗显色剂：1.5g抗坏血酸(C6H8O6，左旋)溶于100mL钼锑抗贮存液中。
[0080] 3、SL-7解磷能力测定
[0081] (1)平板定性测定
[0082] 将单菌落分别点种在解磷菌分离培养基上，37℃培养3～5d后，结果如图3所示，观察透明圈产生的情况，测量并记录解磷透明圈直径(D)。
[0083] (2)定量测定可溶性磷的含量
[0084] 采用钼锑抗比色法，测定SL-7培养液中水溶性磷含量。用可见光分光光度计在波长720nm处测定吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。
[0085] 磷标准曲线绘制：在容量瓶中分别加入相应体积100mg/L的标准磷溶液，加2滴2，6一二硝基苯酚作指示剂，用稀硫酸和10％的NaOH溶液调节pH值，加铝锑抗显色剂5mL，定容至刻度，使标准磷浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/L，摇匀，在室温下(25℃左右)反应30min后用紫外分光光度计在720nm处比色，根据结果绘制标准曲线。
[0086] 培养液中可溶磷含量的测定：将SL-7接种到50mL有机磷(或无机磷)液体培养基中，以不接菌作对照，摇床转速为150r/min，28℃培养3d。培养液转移至无菌的50mL离心管中，采用数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎，破碎20min，使之释放出细胞内的有效磷，以4000r/min的转速离心20min后取2.5mL上清液于50mL容量瓶中加2滴2，6-二硝基苯酚作指示剂，加一滴稀硫酸至反应液为无色，加钼锑抗显色剂5mL，定容，反应。用紫外分光光度计测定上清液于720nm处的OD值。根据标准曲线得出上清液中的有效磷含量。结果如表1所示：
[0087] 表1解磷能力测试结果
[0088]
[0089] 由图3和表1可知，菌株SL-7在无机磷和有机磷培养基平板上都呈现出明显的解磷圈，从而初步判断菌株SL-7具有一定的解磷能力。
[0090] 实施例4
[0091] 为测定氧气含量对菌株SL-7产酶的影响，分别设定摇床转速为140rpm、160rpm、180rpm、200rpm和220rpm，按照4％接种量(每100mL CMC发酵产酶培养基中接入4mL菌悬液)接种于100mL发酵产酶培养基中。在37℃件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。
结果如图4所示：随着发酵液转速的增加，菌株产酶活性呈现先上升后趋于平衡的变化趋势，发酵液转速为200时FPase与CMCase最高，为40.93U/mL和106.56U/mL，综上，该菌的最适产酶转速为200rpm，最佳产酶转速范围为180～200rpm。
[0092] 实施例5
[0093] 为测定温度对菌株SL-7产酶的影响，分别设定摇床温度为28℃、37℃、46℃、55℃和60℃，按照4％接种量(每100mL CMC发酵产酶培养基中接入4mL菌悬液)，接种于100mL发酵产酶培养基中。在转速为200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。结果如图5所示：随着发酵液温度增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势。发酵液温度为37℃时FPase与CMCase最高，为39.09U/mL与108.86U/mL；综上，该菌的最适产酶温度为37℃，最佳产酶温度范围为25～45℃。
[0094] 实施例6
[0095] 分别设定接种量为2％、4％、6％、8％、10％和12％(每100mLCMC发酵产酶培养基中分别接入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL菌悬液)接种于100mLCMC发酵产酶培养基中。在37℃、200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天分别测定CMCase、FPase。结果如图6所示：随着接种体积的增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势，当接种体积为8％时，FPase与CMCase出现最高值为40.94U/mL和115.96U/mL；综上，该菌的最适产酶接种体积为8％，最佳产酶接种体积范围为6～10％。
[0096] 实施例7
[0097] 将菌悬液按8％接种量接种于100mL发酵产酶培养基中，调节发酵产酶培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。在37℃、200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天和测定CMCase、FPase。结果如图7所示：随着发酵液PH增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势。发酵液PH为7时CMCase与FPase最高，为114.31U/mL和54.57U/mL；综上，该菌的最适产酶PH为7，最佳产酶PH范围为6～8。
[0098] 实施例8
[0099] 为测定不同氮源对菌株产酶的影响，分别设定氮源为0.4％蛋白胨、0.4％硫酸铵和0.4％尿素，并将菌悬液按8％接种量接种于100mLCMC发酵产酶培养基中。在37℃，200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天分别测定CMCase、FPase。结果如图8所示：蛋白胨处理中，CMCase和FPase可分别达到119.1U/mL、75.22U/mL：尿素处理中，CMCase和FPase可分别达到59.73U/mL、9.22U/mL：硫酸铵处理中，CMCase和FPase可分别达到75.96/mL、15.87U/mL。蛋白胨处理中的CMCase和FPase相较于尿素和硫酸铵都要高，由此可见蛋白胨可促进菌株产酶，而尿素和硫酸铵均对菌株产酶产生了不同程度的抑制作用。
[0100] 实施例9
[0101] 为测定不同碳源对菌株产酶的影响，分别设定碳源为0.5％葡萄糖、0.5％CMC-Na和1％烟草秸秆粉末(0.5％可溶性碳源或l％不可溶性碳源)，并将菌悬液按8％接种量接种于100mL CMC发酵产酶培养基中。在37℃，200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天分别测定CMCase、FPase。结果如图9所示：CMC—Na处理中，CMCase和FPase可分别达到123.89U/mL、90.71U/mL；烟草秸秆粉末处理中.CMCase和FPase可分别达到105.46U/mL、53.84U/mL；葡萄糖处理中，CMCase和FPase可分别达到59.73U/mL、38.35U/mL。CMC—Na处理中的CMCase和FPase相较于烟草秸秆粉末和葡萄糖都要高，由此可见CMC-Na可促进菌株产酶.而烟草秸秆粉末和葡萄糖均对菌株产酶产生不同程度的抑制作用。
[0102] 实施例10
[0103] 为测定不同碳氮比对菌株产酶的影响，选取上述实验中优化出的最适碳源和最适氮源，分别设定碳氮比为2:1、1:1和1:2，并将菌悬液按8％接种量接种于100mL发酵产酶培养基中。在37℃、200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。结果如图10所示：C/N为2:1处理中，CMCase和FPase可分别达到135.69U/mL、67.85U/mL：C/N为1:1处理中，CMCase和FPase可分别达到120.21U/mL、87.02U/mL：C/N为1:2处理中，CMCase和FPase可分别达到84.07U/mL、103.98U/mL。C/N为2:1处理中的CMCase相较于C/N为1:1和C/N为1:2都要高，由此可见C/N为2:1可促进菌株产酶，而C/N为1:1和C/N为1:2均对菌株产酶产生了不同程度的抑制作用。
[0104] 实施例11
[0105] 1、烟草秸秆高效菌剂的构建
[0106] 将SL-7接种于蛋白胨作为培养基质中唯一氮源、CMC—Na作为培养基质中唯一碳源和C/N为2:1CMC发酵培养基中，在最适产酶培养环境条件为：pH7.0、接种体积8％、转速200rpm、温度37℃培养三天，构建烟草秸秆高效降解菌剂。
[0107] 2、堆制烟草秸秆堆肥
[0108] 2.1菌剂的添加
[0109] 将菌剂添加到喷壶中。然后把烟草秸秆堆肥原料摊开，再用喷壶把菌剂按照与烟草秸秆堆肥原料5：100的质量配比均匀喷洒在摊开的烟草秸秆堆肥原料表面。喷洒完毕后，再搅拌均匀，并调节混合物含水率为50％—60％，开始堆肥。
[0110] 2.2堆体堆制
[0111] 将投加完菌剂的堆肥原料填充到简易堆肥装置中，堆制成高约0.56m、体积约60L的堆体。在堆制过程中。每日定时监测堆体温度，测温点位于堆体中部。自然通风，待堆体温度升至70℃左右时，进入前腐熟阶段，4-5天翻堆一次。至堆体温度降至50℃及以下，每隔2天翻堆一次，至堆体温度降至40℃以下并不再上升时，停止翻堆。待堆体进入后腐熟阶段，每日定时监测堆体中碳元素和氮元素元素的质量比，当碳元素和氮元素的质量比小于20时，则表明后腐熟阶段完成，整个堆制过程也随之结束。
[0112] 本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌SL-7，该菌株SL-7具有强大的降解纤维素和解磷能力，可用于制备烟草秸秆堆肥。
[0113] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
