[0037] 下面结合具体实施例并参照数据对本发明进行详细说明。本发明所列实施例只是为了举例说明本发明,并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0038] 在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般均为本领域普通技术人员常理解的含义。无特殊说明,所使用材料、试剂等均为常规市售。未详细描述的各过程和方法均为本领域公知的常规方法。
[0039] 实施例1:19F-SFB-CML标准对照品的合成及质控
[0040] (1)19F-SFB-CML标准对照品的合成步骤
[0041] 取预先溶解好的1mg/mL CML(羧甲基赖氨酸复合物)的碳酸缓冲溶液(pH=9)25μL至反应管,再加入预先用乙腈溶解的[19F]-SFB(N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯)溶液(1mg/mL) 25μL,然后将反应管置于油浴锅中,65℃反应1h,期间用薄层色谱板监控反应结束后,19
取出反应液加入到半制备型高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化,收集目标产物 F-SFB-CML。并通过质谱及核磁进行结构确证,再通过分析型高效液相色谱法(HPLC)检测其化学纯度。
[0042] (2)19F-SFB-CML标准品的核磁及质谱结构确证
[0043] 上述合成获得的19F-SFB-CML标准品,委托中国药科大学分析测试中心进行结构确证。其分子量经LC-MS确定,测定值[MH]+=327.1(m/z)与计算值326.32(C15H19FN2O5)基本一致;核磁仪器类型为布鲁克AV500,测试频率500兆,测试溶剂为氘代氯仿,测试结果所有氢峰位置和数量与标准品结构能一一对应。标准品结构确证为19F-SFB-CML结构(如图1)。质谱和核磁共振检测谱图如图2和图3所示。
[0044] (3)19F-SFB-CML标准品的纯度检测
[0045] 采用分析型高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为:Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm;检测波长:254nm;流动相:A为含0.1%TFA的水溶液,B为含0.1%TFA的乙腈溶液;梯度洗脱:
梯度从1分钟的90%A和10%B减少到14分钟的50%A和50%B,至17分钟时减少为100%B并维持至20分钟,之后在增加到25分钟的90%A和10%B;流速为1mL/min。经检测其19F-SFB-CML标准品化学纯度大于99%,谱图见图4。
[0046] 实施例2:18F-SFB-CML标记和分离纯化
[0047] (1)18F-SFB-CML的放射性标记合成步骤
[0048] 利用加速器轰击重氧水生产出的18F离子首先经QMA柱子(使用前先用 10mL 0.5M NaHCO3冲洗,再用20mL的灭菌注射用水冲洗)捕获,富集后用K222/K2CO3洗脱至1号反应管,干燥除水后冷却至室温,然后加入一定量的无水乙腈再次干燥除水,冷却至室温。
[0049] 加入SFB(10mg SFB,1mL乙腈溶解)90℃反应7min,反应结束后冷却至室温。然后加入6mL 0.1M的HCl,通气搅拌1min,反应液通过C18柱(使用之前用7.5mL 0.1M的 HCl和2.5mL乙腈的混合液冲洗)至废液瓶。再加入3mL乙腈流经C18柱,将中间产物洗脱至2号反应管(预先加入40μL的四丙基氢氧化铵TPAOH)。
[0050] 加热干燥除乙腈,然后加入TSTU(2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯,10mg 溶于1mL的乙腈中),90℃反应7min,反应结束后冷却至室温。加入5mL 0.1M的HCl,通气搅拌1min,反应液通过C18柱(使用前先用10mL甲醇冲洗,再用20mL的灭菌注射用水冲洗)至废液瓶,加入1mL乙腈流经C18柱,将产品洗脱至产品瓶,此为18F-SFB。
[0051] 取300μL的CML(3mg CML溶于0.01M pH=8.5碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液)于EP管中,再加入50μL的SFB,加入25μL的0.1M Na2CO3溶液,调节pH至8.5左右,65℃反应 20min,反应完成后冷却至室温备用。
[0052] (2)18F-SFB-CML的分离纯化
[0053] 取出反应液使用制备型HPLC进行分离纯化,与19F-SFB-CML标准品进行对照,收集目标产物峰,获得18F-SFB-CML流动相溶液。再在油浴锅中加热下,用高纯氮气吹干,除去所有溶剂后,用微量生理盐水溶解,获得最终产物18F-SFB-CML。
[0054] (3)18F-SFB-CML的质量控制
[0055] a.外观:目检产品瓶应完整无破损
[0056] b.性状:本品为无色透明液体。
[0057] c.pH值:7(用精密pH试纸测定,应为4.5~8.0)。
[0058] d.结构确证及放射性化学纯度:
[0059] 结构确证:因经放射性同位素氟[18F]标记获得的18F-SFB-CML物质的量极其微量,且具有放射性故不便于通过LC-MS或核磁直接对18F-SFB-CML进行结构确证。故用稳定同位素氟[19F]合成大量经LC-MS和核磁结构确证后19F-SFB-CML作为标准对照品(没有放射性),然后采用完全相同的色谱方法进行HPLC检测,将18F-SFB-CML放射性谱图保留时间与19F-SFB-CML标准品紫外谱图保留时间对照,两者保持一致,即可间接确证18F-SFB-CML的结构。
[0060] 通过HPLC检测,18F-SFB-CML保留时间与标准品19F-SFB-CML保留时间相差不得超过±5%。
[0061] 标准对照品品19F-SFB-CML保留时间:11.13min
[0062] 标记纯化产物18F-SFB-CML保留时间:11.10min
[0063] %误差:0.27%
[0064] 放射性化学纯度:97.44%
[0065] 检测方法采用分析型高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为:Agilent 5TC-C18(2)250×4.6 mm;检测波长:254nm;流动相:A为含0.1%TFA(三氟乙酸)的水溶液,B为含0.1%TFA 的乙腈溶液;梯度洗脱:梯度从1分钟的90%A和10%B减少到14分钟的50%A和50%B,至17分钟时减少为100%B并维持至20分钟,之后在增加到25分钟的90%A和10%B;流速为1mL/min,详见图5。
[0066] e.放射性活度浓度:放射性活度浓度应不低370 MBq/mL
[0067] 放射性活度浓度=产品放射性活度/产品总体积
[0068] f.放射性比活度:1.651Ci/μmol or 61.09GBq/μmol。
[0069] (4)18F-SFB-CML的稳定性
[0070] 标记纯化产物18F-SFB-CML的稳定性测定。将经质控合格的最终产品,于常温下放置4h 之后,通过高效液相色谱法(HPLC)检测产物的放射性化学纯度。本实施例选取了第3h、第4h两个时间点进行HPLC检测,其放射性化学纯度分别为97.31%、97.33%,由此证明
18F-SFB-CML在体外溶媒中4h内稳定性较好,未发现有脱氟显像(如图6)。
[0071] 实施例3:ApoE-/-小鼠micro PET扫描
[0072] (1)糖尿病动脉粥样硬化动物模型的构建
[0073] 本实验所用雄性apoE-/-小鼠均于江苏大学实验动物中心SPF级小鼠房饲喂。饲喂条件:温度22±2℃,湿度40-60%,12小时循环照明,普通饮食,自由摄取食、水。所有进入SPF 房中的物品都须经过高温高压消毒,实行严格的无菌操作。6周龄时,实验组小鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,溶于0.05mol/L pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中)40mg/kg/day,连续5 天。2周后血糖水平>300mg/dL的小鼠纳入本实施例研究对象,并由普通饮食转为半合成型高脂饮食(high-fat diet,HFD)(21%脂肪,0.15%胆固醇,其他成分同普通饮食),连续四个月。对照组为6周龄雄性apoE-/-小鼠连续普通饮食饲喂4个月。
[0074] (2)18F-SFB-CML micro PET显像
[0075] 扫描前称重,异氟烷/氧气混合气体麻醉(1.5-2.0%),尾静脉注射18F-SFB-CML(注射剂量7.4MBq,注射体积150μL),进行动态扫描1h点并在注射后2h进行Micro PET动态扫描 10min。扫描结束对小鼠行安乐死并分离主动脉,进行主动脉离体micro PET扫描。扫描层厚: 0.78mm,矩阵:128*128,采集时间10min,采集能窗350-650kev。扫描采集结束后,将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建,迭代2次,重建后利用西门子扫描仪自带分析软件分析。
[0076] (3)标本的采集与HE染色
[0077] 暴露小鼠心脏后,分离自主动脉根至髂总分支的动脉全长,除去外膜结缔组织与脂肪组织。PBS灌洗后一部分用于提取蛋白作westernblot检测,一部分用于检测钙含量和碱性磷酸酶活性,一部分用10%中性缓冲福尔马林固定,一部分放液氮罐中保存。将10%中性缓冲福尔马林固定的标本经如下过程:经蒸馏水冲洗0.5~1h,70%酒精浸泡24h,80%酒精浸泡 24h,95%酒精I浸泡30min,95%酒精II浸泡30min,100%酒精I浸泡30min,100%酒精II浸泡30min,100%酒精与二甲苯混合液(1:1)浸泡20min,二甲苯I浸泡20min,二甲苯II浸泡20min,软蜡浸泡10min,硬蜡浸泡10min,包埋制成石蜡块,连续切片(厚度为5μm),摊片,60℃烤片1h,HE染色。
[0078] (4)18F-SFB-CML对糖尿病粥样硬化斑块的示踪和HE验证
[0079] 由microPET扫描可见,静脉注射显像剂5min后,模型组与对照组小鼠的心血管系统都有18F-SFB-CML的富集,但在15min后,对照组的显像剂迅速排泄至膀胱;而模型组的心脏和血管系统排泄很缓慢,即使到了55min时仍有大量的显像剂富集在主动脉及其分支系18 18
统。这在2h离体血管的microPET扫描中显示的非常清晰。进一步的对比 F-SFB-CML和 F-FDG,发现同为糖尿病动脉粥样硬化模型,静脉用药2h后18F-FDG在主动脉及其分支的富集远远低于18F-SFB-CML。通过对显像剂不同富集程度主动脉节段的HE染色发现,18F-SFB-CML的富集程度能够准确的反映出斑块的大小和血管腔狭窄程度,但18F-FDG的富集与斑块病变程度存在一定的出入。
[0080] 实施例4:LDLR+/-仓鼠micro PET/CT扫描
[0081] 本实验所用雄性LDLR+/-仓鼠均于江苏大学实验动物中心SPF级动物房饲喂。6周龄时,糖尿病动脉粥样硬化组仓鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,溶于0.05mol/L pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中)40mg/kg/day,连续5天。2周后血糖水平>300mg/dL的小鼠纳入本实施例研究对象,并由普通饮食转为半合成型高脂饮食(high-fat diet,HFD)(21%脂肪,0.15%胆固醇,其他成分同普通饮食),连续四个月。对照组为6周龄雄性LDLR+/-仓鼠连续普通饮食饲喂4个月。动脉粥样硬化组仓鼠给予半合成型高脂饮食(high-fat diet,HFD)(21%脂肪,0.15%胆固醇,其他成分同普通饮食),连续四个月。
[0082] 造模结束后通过异氟烷麻醉仓鼠,待其翻正反射消失,舌下静脉注射显影剂(每只200μci 左右)后30分钟,固定至micro PET/CT扫描床,采集方式为静态10min。
[0083] 图10为糖尿病动脉粥样硬化LDLR+/-仓鼠18F-SFB-CML microPET/CT多维静态扫描结果,从扫描结果可知18F-SFB-CML可有效示踪糖尿病动脉粥样硬化模型仓鼠主动脉内斑块。
[0084] 实施例5:糖尿病足截肢患者离体血管micro PET/CT扫描
[0085] 分离糖尿病足截肢患者及车祸截肢患者下肢胫前动脉血管。用PBS稀释放射性药物18F-SFB-CML,终浓度为1mCi/40mL,将血管浸入18F标记的药物中,浸泡60min后,取出血管,用PBS冲洗数遍,放置于microPET/CT静态扫描10min。
[0086] 图11为糖尿病动脉粥样硬化截肢患者下肢胫前动脉18F-SFB-CML microPET/CT多维静态扫描结果,从扫描结果可知18F-SFB-CML可有效示踪糖尿病动脉粥样硬化患者下肢胫前动脉内斑块。