[0039] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0040] 本发明提出一种黄曲霉毒素B1毒性的检测方法，所述黄曲霉毒素B1毒性的检测方法包括如下步骤：
[0041] 步骤S10、配制含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液；
[0042] 黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是主要由曲霉属中的黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)污染谷物和谷物产品后所产生的一种次生代谢物，是一种毒性极强的剧毒物质，已鉴定出的AFs多达20余种，其中在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最为常见，其毒性和致癌性也最强。将适量黄曲霉毒素B1溶解于斑马鱼胚胎培养液中，配制含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液，作为检测黄曲霉毒素B1毒性的培养液。
[0043] 步骤S30、用含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液培养斑马鱼胚胎24～120h；
[0044] 斑马鱼是具有养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等特点，是生命科学研究中一种重要的模式生物，有利于提高毒性检测的效率、直观性和准确性。用含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液于特定条件下培养斑马鱼胚胎，斑马鱼胚胎在受精48h后即可破膜而出，变成斑马鱼幼鱼，72～96h后能自由游动。
[0045] 步骤S50、观察记录斑马鱼胚胎的死亡率，以及由斑马鱼胚胎孵化的斑马鱼幼鱼的孵化率、畸形率、心包囊和卵黄囊面积、幼鱼体面积，计算心包囊/幼体面积比和卵黄囊/幼体面积比，判断黄曲霉毒素B1对斑马鱼胚胎的毒性作用。
[0046] 用含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液培养斑马鱼胚胎，每隔12h观察并记录斑马鱼胚胎的死亡数，计算斑马鱼胚胎的死亡率，进而分析AFB1对斑马鱼胚胎的急性毒性作用。
[0047] 继续用含有AFB1不同浓度的培养液培养斑马鱼胚胎，并饲养由斑马鱼胚胎孵化出的斑马鱼幼鱼，每隔12h观察并记录斑马鱼幼鱼的形态特征，记录孵化数和畸形数，然后利用麻醉剂将斑马鱼幼鱼麻醉后，放置在凹型载玻片上，用琼脂糖固定斑马鱼幼鱼，通过解剖镜测量斑马鱼幼鱼的卵黄囊和心包囊面积、幼鱼体面积以及心率(20s)等参数，计算斑马鱼幼鱼的孵化率、畸形率、心包囊/幼体面积比和卵黄囊/幼体面积比，进而分析AFB1对斑马鱼胚胎的慢性毒性作用。
[0048] 本发明技术方案中，以斑马鱼为试验对象进行黄曲霉毒素B1的检测，能够快速获得大量同质性好的试验动物，降低试验成本，且容易观察中毒症状，可实时直观地观测鱼体各组织的病理变化，提高了黄曲霉毒素B1检测的效率、直观性和准确性。
[0049] 可选地，步骤S10包括：
[0050] 步骤S11、将二甲基亚砜与养殖用水混合，制成二甲基亚砜储备液；
[0051] 以二甲基亚砜(DMSO)作为溶解AFB1的溶剂，提高AFB1在所述培养液中的溶解性，具体做法如下：将DMSO(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)与养殖用水混合，制备DMSO的体积浓度为1％的DMSO溶液，作为二甲基亚砜储备液(DMSO储备液)。
[0052] 步骤S12、将黄曲霉毒素B1加入二甲基亚砜储备液中，通过超声波破碎获得黄曲霉毒素B1母液；
[0053] 向DMSO储备液中加入AFB1，通过超声波破碎后摇匀，制成AFB1浓度为3200μM/L的黄曲霉毒素B1母液(AFB1母液)。
[0054] 其中，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为8～10min。
[0055] 步骤S13、向黄曲霉毒素B1母液中加入养殖用水，制成黄曲霉毒素B1储备液；
[0056] 向AFB1母液中加入养殖用水，将AFB1母液稀释成AFB1浓度为32μM/L的AFB1储备液。
[0057] 步骤S14、取黄曲霉毒素B1储备液与二甲基亚砜储备液和养殖用水混合，制成含有不同黄曲霉毒素B1浓度的培养液；
[0058] 其中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。
[0059] 以上述配制的AFB1储备液、DMSO储备液和养殖用水为原料，配制含有AFB1不同浓度的培养液，制备方法简单，且AFB1的溶解效果好，浓度配制准确(误差可控制在0.02％以内)。
[0060] 可选地，在步骤S30之前还包括：
[0061] 步骤S21、将成年斑马鱼按照雌雄比为1：2～1：3的比例移至产卵盒；
[0062] 可选地，在步骤S21之前还包括：将斑马鱼置于具有恒温循环水系统的培养缸中饲养，其中，所述培养缸中的养殖用水为曝气加热的自来水，培养缸中的水温为26～30℃，水中溶氧大于5.0mg/L，pH为6.8～7.2，保持光照12～16h/黑暗8～12h的光照周期。其中，成年鱼的饲养饵料为热带小鱼饲料(购自北京疯狂水草公司)和丰年虫，每天7：00～9：00、12：00～15：00以及18：00～20：00分别投食饵料；幼鱼的饲养饵料为草履虫，每天投食一次。以此方式饲养斑马鱼，斑马鱼能够正常采食，且生长发育状况良好，成活率可达98％以上。
[0063] 为了提高胚胎的受精率，在取卵前天晚上9：00时，正常投食后，挑选健康成年的野生型斑马鱼，从培养缸中移至产卵盒中，雌雄比为1：2～1：3。
[0064] 步骤S22、将产卵盒放入恒温箱中保温过夜后，自然交配并收集受精卵；
[0065] 将产卵盒放入恒温箱中保温过夜，次日早上开启光照，使雌鱼和雄鱼自然交配，大约15min后开始收集受精卵，放置于平皿中，用胶头滴管清理粪便和杂质。
[0066] 其中，所述保温过夜的温度为26～28℃，时间为10～14h。
[0067] 步骤S23、将受精卵放入恒温箱中进行恒温培养后，在解剖镜下挑选发育正常的原肠胚作为斑马鱼胚胎。
[0068] 其中，恒温培养的温度为26～28℃，恒温培养的时间为2.5～3.5h。将清洗后的受精卵放入恒温箱中恒温培养，然后利用解剖镜挑选受精3h后发育正常的原肠胚作为斑马鱼胚胎。按照上述步骤选择并培养斑马鱼胚胎，斑马鱼雌雄交配行为明显，胚胎受精率高，且孵化率可达99％以上，胚胎的破膜效果好。
[0069] 可选地，步骤S30包括：
[0070] 步骤S31、将选取的斑马鱼胚胎清洗后移入六孔板中；
[0071] 将挑选好的斑马鱼胚胎再次冲洗3～5次，然后随机分配到六孔板中，每孔40个胚胎。
[0072] 步骤S32、向六孔板的孔中加入不同浓度的培养液，放入恒温箱中进行恒温培养。
[0073] 其中，恒温培养的温度为26～28℃，每隔12h更换所述培养液。向六孔板的孔中加入10mL的不同浓度的培养液，放入恒温箱中进行恒温培养，斑马鱼胚胎受精48h后即可破膜而出，72～96h后就能自由游动。
[0074] 以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0075] 实施例1
[0076] 斑马鱼饲养管理，方法如下：
[0077] (1)将斑马鱼饲养在恒温循环水系统中，养殖用水为曝气加热的自来水，水箱中使用加热棒加热使水温维持在28±1℃，溶氧大于5.0mg/L，pH为7.0±0.2，光照交替进行(光照14h/黑暗10h)。其中，成年鱼的饲养饵料为热带小鱼饲料(购自北京疯狂水草公司)和丰年虫，每天7：00～9：00、12：00～15：00以及18：00～20：00分别投食饵料；幼鱼的饲养饵料为草履虫，每天投食一次。
[0078] (2)丰年虫的饲养方法：向孵化瓶中加水800mL、3.2g食盐以及少许虫，将整个装置放进水桶中，使用加热棒加热使水温保持在28±1℃；打开气阀，往装置中充气，使丰年虫卵处于翻滚运动状态，持续时间为24h；关闭气阀，取出加热棒，静置，待充全部沉到底部后，从底部收集丰年虫。
[0079] (3)草履虫的饲养方法：将干燥的稻草剪短，加入蒸馏水，在电子万用炉上加热至沸腾10分钟，以达到灭菌和软化稻草的作用；待烧杯中水温下降至室温，向里边加入酵母，酵母粉和些许草履虫，用报纸封住烧杯口，放置2～3天，让草履虫大量繁殖；用滤网筛去培养液的废液，然后用纯化水冲洗网面，接着用小烧杯收集草履虫(可通过胶头滴管吸取草履虫向斑马鱼投食)。
[0080] 实施例2
[0081] 斑马鱼胚胎的选择，方法如下：
[0082] (1)在取卵前一晚9:00时，用渔网将斑马鱼(雌雄比为1：3)从培养缸移至产卵盒中，将产卵盒放入人工气候箱(RTOP1000B，浙江托普仪器有限公司)中保温过夜，温度控制为27±1℃，次日早上9：00开启光照，使雌鱼和雄鱼自然交配，15min后开始收集受精卵；
[0083] (2)将受精卵放置于平皿中，使用胶头滴管清理粪便和杂质后，放入人工气候箱中培养3h，温度控制为27±1℃，利用解剖镜挑选受精后3小时的发育正常原肠胚。
[0084] 实施例3
[0085] 不同AFB1浓度的培养液的配制，方法如下：
[0086] (1)DMSO母液的配置：在4℃冰箱中取出10mL的DMSO(分析纯)装入试管中，用锡箔包住试管包住，放在室温下保存，用作试验DMSO母液；
[0087] (2)DMSO储备液的配置：用移液枪移取0.5mL的DMSO母液装入离心管中，加入养殖水49.5mL，配置成50mL的DMSO体积浓度为1％的DMSO溶液；
[0088] (3)AFB1母液的配置：取1mg AFB1纯品(99.9％)，加入lmL的DMSO母液，将混合物置于超声波破碎仪(20-25kHz)中破碎处理10min后，充分摇匀，配成AFB1浓度为3200μM/L的AFB1母液；
[0089] (4)AFB1储备液的配置：用移液枪吸取100μL的AFB1母液进离心管中，加养殖水配置成10mL的AFB1浓度为32μM/L的AFB1储备液；
[0090] (5)以养殖用水、AFB1储备液和DMSO储备液为原料，配制不同AFB1浓度的培养液，分别为空白组、DMSO组和AFB1组，其中，空白组的培养液为纯养殖用水，DMSO组的培养液为DMSO体积浓度为2.5mL/L的DMSO溶液，AFB1组包括AFB1-1、AFB1-2、AFB1-3、AFB1-4、AFB1-5、AFB1-6、AFB1-7和AFB1-8组，其中AFB1的浓度以及培养液配比如表1所示。
[0091] 表1 实施例3中不同AFB1浓度的培养液的配比
[0092]
[0093]
[0094] 实施例4
[0095] AFB1对斑马鱼胚胎的急性毒性作用，试验方法如下：
[0096] (1)将实施例2挑选好的胚胎再冲洗3-5次，随机分配到六孔板中，每孔40个胚胎，分别加入实施例3制备的空白组、DMSO组以及AFB1-4、AFB1-5、AFB1-6、AFB1-7和AFB1-8组的培养液(10mL)，然后将六孔板放入人工气候箱中继续培养，每组重复6个，每个重复40个胚胎；
[0097] (2)每隔12h观察一次并更换培养液，记录斑马鱼胚胎或幼鱼死亡数(斑马鱼没有肉眼可见的运动，触碰身体无明显反应，可判断该斑马鱼死亡)，并及时清除死鱼和胚胎脱落下来的囊膜，计算死亡率和半数致死浓度，其中，半数致死浓度LC50为引起一半斑马鱼死亡的AFB1浓度，可通过SPSS19.0软件统计各组斑马鱼胚胎的死亡数来计算，其中，死亡率的计算公式如下：
[0098] 死亡率＝每个重复组死亡个体数/每个重复组供试个体数×100％
[0099] 死亡率计算结果如图1所示，由图1可知：空白组和DMSO组培养的斑马鱼胚胎全部存活，而由AFB1组培养的斑马鱼胚胎中，斑马鱼胚胎的死亡率随培养时间的延长而增大，尤其是在受精后48h时的死亡率显著增大，且随着AFB1浓度的增加而逐渐增大。
[0100] 当AFB1浓度为1.2μM/L时(AFB1-8组)，斑马鱼胚胎在受精后84h时全部死亡，死亡率为100％；当AFB1浓度为0.8μM/L时(AFB1-7组)，斑马鱼胚胎在受精后72h时的死亡率为85％，受精后84h时的死亡率达到100％；当AFB1浓度为0.6μM/L时(AFB1-6组)，斑马鱼胚胎在受精后84h时的死亡率为9％，受精后96h时的死亡率达到80％；当AFB1浓度为0.5μM/L时(AFB1-5组)，斑马鱼胚胎在受精后84h时的死亡率为17％，受精后96h时的死亡率达到75％；
当AFB1浓度为0.4μM/L时(AFB1-4组)，斑马鱼胚胎在受精后84h时几乎全部存活，在受精后
96h时的死亡率仅为14％。说明当AFB1浓度大于或等于0.5μM/L时，对斑马鱼胚胎的毒害作用仍然很显著，当AFB1浓度为0.4μM/L时，对斑马鱼胚胎的毒害作用较小。
[0101] 通过spss19.0软件分析，在斑马鱼胚胎受精后96h时，AFB1对斑马鱼胚胎的半数致死浓度为LC50＝0.491μM/L，95％置信区间上限为0.517μM/L，下限为0.463μM/L。为便于观察AFB1对斑马鱼胚胎的慢性毒性作用，将后续实施例中培养液中AFB1的最高浓度调整为0.4μM/L。
[0102] 实施例5
[0103] AFB1对斑马鱼胚胎的慢性毒性作用，试验方法如下：
[0104] (1)将实施例2挑选好的胚胎再冲洗3-5次，随机分配到六孔板中，每孔40个胚胎，分别加入实施例3制备的空白组、DMSO组以及AFB1-1、AFB1-2、AFB1-3和AFB1-4组的培养液(10mL)，然后将六孔板放入人工气候箱中继续培养，每组重复6个，每个重复40个胚胎；
[0105] (2)每隔24h更换一次培养液，每隔12h观察一次斑马鱼胚胎发育情况，斑马鱼幼鱼从卵膜中脱落出来表示孵化完成，未脱落出来表示未完成孵化；斑马鱼的畸形主要表现为脊椎和尾部弯曲、心肌肿大、心率不稳等，记录斑马鱼胚胎的孵化数、死亡数和畸形数，按照实施例4中的计算公式计算斑马鱼胚胎的死亡率，并根据孵化数和畸形数，并计算孵化率和畸形率，计算公式如下：
[0106] 孵化率＝每个重复组孵化个体数/每个重复组供试个体数×100％；
[0107] 畸形率＝每个重复组畸形个体数/每个重复组孵化个体数×100％。
[0108] (3)使用Tucsen相机(图森TCH-5.0)拍摄斑马鱼幼鱼的形态特征；
[0109] (4)利用MS222麻醉剂麻醉斑马鱼幼鱼，放置在凹型载玻片上，然后用琼脂糖固定斑马鱼幼鱼，通过解剖镜(OLYMPUS SZ2-LGB)测量受精96h后斑马鱼幼鱼的卵黄囊和心包囊面积、幼鱼体面积、心率(20s)等参数，计算斑马鱼幼鱼的卵黄囊/幼体面积比和心包囊/幼体面积比，其计算公式如下：
[0110] 卵黄囊/幼体面积比＝卵黄囊面积/幼体面积×100％；
[0111] 心包囊/幼体面积比＝心包囊面积/幼体面积×100％。
[0112] 通过对实施例5的计算结果的分析，发现在本实施例中，AFB1的浓度对斑马鱼胚胎产生了如下各项影响：
[0113] 1、不同AFB1浓度对斑马鱼胚胎或幼鱼的死亡率的影响
[0114] 死亡率的计算结果如表2所示，由表2可知：各组在24～72hpf的死亡率差别不明显；在96hpf，AFB1-4组(AFB1浓度为0.4μM/L)的死亡率高达18％，其他各组的死亡率均在0～2％范围内，AFB1-4组的死亡率明显高于其他各组；在120hpf，AFB1-1、AFB1-2、AFB1-3和AFB1-4组的死亡率分别为2％、6％、37％和74％，AFB1浓度为0.4μM/L时的死亡率显著高于AFB1浓度为0.3μM/L时的死亡率，且这两组的死亡率显著高于其他各组(表2中，hpf为受精后的小时数；同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05))。
[0115] 表2 不同AFB1浓度对斑马鱼胚胎或幼鱼死亡率(％)的影响(平均值±标准差)[0116]组别 24hpf 48hpf 72hpf 96hpf 120hpf
空白组 0.0±0.0a 0±0.0a 0.0±0.0a 0.0±0.0a 0.0±0.0a
DMSO组 0.0±0.0a 0±0.0a 0.0±0.0a 0.0±0.0a 0.0±0.0a
a a a a a
AFB1-1组 0.0±0.0 0±0.0 1.7±1.9 2.1±2.0 2.1±2.2
AFB1-2组 0.0±0.0a 0.8±1.3a 1.3±2.2a 1.7±2.4a 6.3±6.8a
AFB1-3组 0.0±0.0a 0.0±0.0a 0.0±0.0a 1.3±1.6a 37.1±6.2b
AFB1-4组 0.8±1.7a 1.3±2.1a 1.3±2.4a 18.3±10.1b 74.2±2.3c
[0117] 2、不同AFB1浓度对斑马鱼胚胎或幼鱼的孵化率的影响
[0118] 孵化率的计算结果如表3所示，由表3可知：在84hpf，培养液中AFB1的添加没有明显影响斑马鱼胚胎的最终孵化率。其中，在表2中，hpf(hours post fertilization)为受精后的小时数；同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05)。
[0119] 表3 AFB1对斑马鱼胚胎或幼鱼孵化率(％)的的影响(平均值±标准差)
[0120]
[0121]
[0122] 3、不同AFB1浓度对斑马鱼胚胎心率的影响
[0123] 记录结果如图2所示，由图2可知：AFB1组的斑马鱼胚胎的20s心率显著高于空白组和DMSO组，且斑马鱼胚胎的20s心率与AFB1的浓度成正相关(图2中，同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05))。
[0124] 4、不同AFB1浓度对斑马鱼心包囊/幼体面积比的影响
[0125] 计算结果如图3所示，由图4可知：AFB1组的斑马鱼的心包囊/幼体面积比显著高于空白组和DMSO组，且当AFB1的浓度为0.2μM/L、0.3μM/L和0.4μM/L时，可引起斑马鱼心包囊肿大，对斑马鱼心包囊产生毒性(图3中，同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05))。
[0126] 5、不同AFB1浓度对斑马鱼卵黄囊/幼体面积比的影响
[0127] 计算结果如图4所示，由图4可知：AFB1组的斑马鱼的卵黄囊/幼体面积比显著高于空白组和DMSO组，且当AFB1的浓度为0.3μM/L和0.4μM/L时，对斑马鱼卵黄囊发育产生毒性(图4中，同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05))。
[0128] 6、不同AFB1浓度对斑马鱼畸形率的影响
[0129] 一般来说，正常的斑马鱼身体比较匀称且各器官组织发育良好，如图5A所示；鱼鳔未发育的斑马鱼一般来说看不见鱼鳔，如图5B所示；体轴弯曲的斑马鱼身体呈倒钩状或波浪形，如图5C所示；尾巴弯曲的斑马鱼可明显观察到其尾部呈钩状，如图5D所示；心包囊水肿的斑马鱼明显可以观察到其心包囊异常肿大，如图5E所示；严重畸形的的斑马鱼，如图5F所示。参考图5，观察并计算斑马鱼的发育畸形率，计算结果如图6所示，由图6可知：AFB1组的斑马鱼的鱼鳔畸形率显著高于空白组和DMSO组，斑马鱼的鱼尾畸形率高于空白组和DMSO组，且当AFB1的浓度为0.3μM/L和0.4μM/L时，会产生诱导斑马鱼畸形的毒性作用(图6中，同列各数值右上角上标不同表示均值有显著差异(p＜0.05))。
[0130] 综上所述，通过本发明提出的黄曲霉毒素B1毒性的检测方法，可以直观地观测到AFB1引起斑马鱼一系列的病理变化，如增加斑马鱼死亡率、畸形率、卵黄囊/幼体面积比和心包囊/幼体面积比，降低孵化率，引起心肌肿大、心包囊水肿，心率不稳、鱼鳔未发育等系列病理变化，成功提供了一种通过斑马鱼AFB1中毒的病理变化来检测AFB1毒性的方法，发育毒性反应快，病理变化直观可见，大大节约了试验时间和饲养成本，提高了黄曲霉毒素B1检测的效率、直观性和准确性。
[0131] 以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
