[0031] 以下结合具体实施例对本发明的菌株作进一步详细的说明。
[0032] 实施例1、亳菊内生柄孢壳BJF10的筛选
[0033] 本实施例采用的供试病原菌：串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)，玉米弯孢菌(Curvularia lunata)，腐霉菌(Pythium)。供试病原菌分别在PDA培养基上28℃活化4～5天备用。
[0034] 本实施例的筛选的步骤主要包括：
[0035] (1)亳菊内生真菌获取：将亳菊健康植株先用流水冲洗干净并晾干，将其剪成几部分放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡3min，后用无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞漂洗30sec，然后再用无菌水冲洗3～4次。分别用PDA和LB培养基进行培养，细菌培养温度是37℃，真菌培养温度是28℃。培养3～4d后，根据其断面处爬出的菌落形态、颜色等挑取菌落，经划线法反复纯化菌株后，4℃保存备用。
[0036] (2)初筛：采用平板对峙法，将PDA平板培养3d的供试病原菌打成直径6mm菌饼接种于PDA培养基的培养皿中央，在距PDA平板中心3cm处同一直线的两点上分别接种2个亳菊内生真菌菌饼(6mm)，对照不接亳菊内生真菌菌饼，重复3皿，在28℃下培养5～7天后,每天观察并记录抑菌情况，选取对病原菌生长有明显抑制作用，并且被抑制菌丝边缘平齐的内生真菌菌株进入后续复筛。
[0037] (3)复筛：进入复筛的内生真菌菌株，同样按平板对峙法进行实验，在28℃下培养，直到对照组平板长满病原菌，测量处理组病原菌半径，并计算抑菌率，按如下方法计算抑菌率：抑菌率＝(对照病原菌菌落半径－对峙培养病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径×100﹪。
[0038] 对峙平板培养部分结果如图1所示。
[0039] 按照抑菌率的计算，得出BJF10对4种病原菌抑菌率，表明BJF10具有很强的抑菌活性，如表1。
[0040]
[0041] 筛选结果发现，菌株BJF10对4种病原真菌均具有很强的抑菌活性，而且BJF10具有繁殖迅速的特点，生长速度约是其他内生真菌的2倍，出现包围病原菌的抑菌现象。菌株BJF10主要是通过生存空间和营养竞争来抑制病原菌的生长。
[0042] 实施例2、亳菊内生柄孢壳BJF10的形态学及分子学鉴定
[0043] (1)内生菌BJF10形态学鉴定
[0044] 采用平板培养基培养法观察菌落的大小、颜色、菌落表面的纹饰、菌落边缘情况等宏观性状。采用显微镜检方法在低倍镜和40倍物镜下观察插片培养的活性真菌菌丝和孢子形态等微观性状。
[0045] 培养观察后得出内生真菌BJF10的具体菌落形态见表2和图2,真菌菌丝和孢子形态见图3。
[0046]
[0047] (2)内生菌BJF10分子生物学鉴定
[0048] 本发明实施例所涉及的试剂：
[0049] (1)DNA提取试剂
[0050] TE溶液：10mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA；
[0051] 3M NH4AC：称取乙酸铵24.61g，加ddH2O溶解，定容至100mL，灭菌；
[0052] CTAB提取液：1.4mol/L NaCl，2％CTAB，0.02mol/L EDTA，2％β‑巯基乙醇，0.1mol/L Tris·HCl(pH8.0)；
[0053] 70％乙醇，苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，异丙醇等。
[0054] (2)琼脂糖凝胶电泳试剂
[0055] 6×Loading Buffer：称取蔗糖40g，加ddH2O定容至100mL，灭菌，补加溴酚兰0.25g，二甲基苯氯FF 0.25g。
[0056] 50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，量取冰醋酸57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL，调pH 8.0，灭菌。
[0057] (3)PCR扩增试剂
[0058] 2xPCR Mix：100mM KCl，20mM Tris‑HCl，3mM MgCl2，400μM dNTPs，0.1U/μL Taq DNA聚合酶，溴酚蓝。
[0059] 扩增真菌ITS序列引物：
[0060] ITS4(SEQ ID NO.1)：5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’，
[0061] ITS5(SEQ ID NO.2)：5’‑GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG‑3’，
[0062] 引物由上海生工生物生物工程股份有限公司合成。
[0063] 内生菌BJF10基因组DNA的提取，采用CTAB法提取，主要参照易庆平的方法，步骤如下：1)直径为4mm的打孔器打孔，用接种针挑取菌饼一块，放入含100ml的PD中，28℃，120rpm，恒温摇床培养3天；2)将得到的新鲜菌丝用4层纱布过滤，并用蒸馏水冲洗3～5遍，拧干，放入已灭菌的研钵中加适量石英砂研磨；3)将研磨好的菌丝用小勺装入已灭菌1.5ml的离心管中；在离心管中加入提前预热30min的CTAB提取液600μl，菌丝和CTAB混合后，65℃，水浴30～60min，10min左右摇匀一次；4℃，12000rpm，离心10min；4)将离心管取出，弃上清，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)振荡混匀后，4℃，12000rpm，离心10min；5)取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，冰浴沉淀30min；6)取出冰浴的离心管，8000rpm，4℃，离心10min，弃上清，向沉淀中加入300μl TE，溶解后再加30μl醋酸铵(3M)，660μl无水乙醇，混匀后冰浴20min；7)4℃，8000rpm，离心20min，弃上清，用500μl 70％乙醇洗涤沉淀，之后再4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；8)待沉淀吹干后，加入50μL TE，充分溶解后加入2μl RNA酶，37℃水浴30min；﹣20℃保存。
[0064] 凝胶电泳检测：取5μL DNA与1μL 6×Loading Buffer混合，在质量浓度0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，50×TAE为电泳缓冲液，电泳电压110mV,电泳30min后EB染色20min，最后在Bio‑RAD凝胶成像系统下检测并摄像。
[0065] ITS区段的PCR扩增及检测：采用ITS真菌通用引物ITS4，ITS5进行PCR扩增。25μL反应体系见下表3。于95℃预变性5min后，反应程序见下表3。
[0066]
[0067] 取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上，110V电泳，EB染色20min后于凝胶成像仪拍照。
[0068] 通过对亳菊内生真菌BJF10基因组DNA的提取，可获基因组片段大小约为23kb，结果如图4所示。再利用ITS序列通用引物对其扩增，获得大约600bp的特异性条带，结果如图5所示。菌株ITS扩增产物经上海生工生物工程有限公司成功测序后，得到BJF10的ITS序列。BJF10菌株序列长度为592bp，通过TBLAST GeneBank数据库的基因序列显示并构建生物进化树，如图6所示，发现特性菌株BJF10与柄孢壳属(Zopfiella sp.)的相似性最高，可达
99％。
[0069] 实施例3、亳菊内生柄孢壳BJF10对纤维素降解功能的测试
[0070] 本例所涉的培养基：1)CMC‑Na培养基(g/L):NaCl 6.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.1g，K2HPO4 2.0g，CMC‑Na 10.0g，(NH4)2SO4 2.0g，琼脂15.0g pH值7.0～7.4。
2)CMC酶活检测液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，CMC‑Na 10.0g，NaCl
1.5g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，蒸馏水，pH值7.0。3)滤纸酶活检测液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，新华滤纸0.05g，NaCl 1.5g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O
0.3g，蒸馏水1000mL，pH值7.0g。以上培养基均在0.1MPa，121℃灭菌25min，待温度冷却至40～50℃备用。
[0071] 鉴别纤维素降解相关溶液：1)1mg/mL刚果红溶液：称取1g刚果红定容至1000mL，4℃冰箱保存备用；2)1mol/L氯化钠溶液：称取58.5g氯化钠定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
[0072] 纤维素酶活测定相关溶液：1)缓冲溶液：配取50mL缓冲溶液以0.2mol/L醋酸钠溶液与0.2mol/L醋酸溶液分别量取35.2mL和14.8mL；2)DNS试剂：称取6.3g 3,5‑二硝基水杨酸、21.0g NaOH于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解,以及500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，最后定容至1000mL，装入棕色试剂瓶中，保存一星期稳定后备用；3)0.5％羧甲基纤维素钠底物溶液：5g羧甲基纤维素钠溶于1000mL缓冲溶液中，备用。
[0073] (1)BJF10纤维素降解能力的确定
[0074] 将PDA上培养3d的内生菌BJF10打成直径5mm菌饼接种于CMC‑Na培养基的培养皿中央，28℃培养4d；用质量浓度为1mg/mL刚果红染色15min，倾去染液，加入物质的量浓度为1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，测透明圈的直径与菌落直径，通过透明圈直径/菌落直径大小比较菌株降解纤维素能力的强弱。
[0075] 将内生菌BJF10接种到CMC‑Na培养基上，内生菌BJF10可在CMC‑Na培养基上生长，经刚果红染色法复筛后，内生菌BJF10产生明显的透明圈，28℃培养4d后计算其透明圈直径与菌落直径的比值。在进行实验的所有内生菌中，只有BJF10和BJF6有明显的透明圈，内生菌BJF10透明圈与菌落直径比值较大，初步说明内生菌BJF10降解纤维素的能力较强，如图7、表4所示。
[0076]
[0077] (2)BJF10降解纤维素酶活的测定
[0078] 1)葡萄糖标准曲线
[0079] 标准葡萄糖溶液：葡萄糖在108℃烘箱内烘干30min～1h后，准确称取0.1g葡萄糖用少量蒸馏水溶解后定容至100mL，再分别取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL葡萄糖溶液用蒸馏水稀释至2mL，加入3mL DNS试剂沸水浴10min，立即用冷水终止反应，另用0mL，在波长为540nm下测定光吸收值，以光吸收值(OD值)作为横坐标，以葡萄糖质量(mg/mL)作为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线及曲线方程式。如图8所示，y＝
2
0.1776x+0.0056，R＝0.9985。
[0080] 2)纤维素酶活测定
[0081] 将复筛获得的高产菌株接种于CMC酶活检测液体发酵培养基及滤纸酶活检测液体发酵培养基，28℃,160r/min震荡培养，5000r/min离心10min，分别取上清液检测CMC酶活及滤纸酶活。本研究测定了目的菌株发酵1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d上清液的纤维素酶活性。根据葡萄糖标准曲线得到回归方程，通过测定吸光值计算还原糖生成量并进一步计算发酵上清液的纤维素酶活性。
[0082] CMCase测定：酶促反应体系包括用0.2mol/L pH4.8的乙酸缓冲液配置的1％CMC‑Na溶液1mL，目的菌株发酵上清液1mL(对照管加入灭活的发酵上清液，灭活方法采用菌液沸水10min)，充分混匀后置于50℃酶促反应30min后取出，迅速加入DNS试剂3mL，置于沸水浴显色10min，取出后立即流水冷却至室温，用去离子水定容至25mL，摇匀，用对照管调零，在540nm测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的量。
[0083] FPase测定：酶促反应体系包括0.2mol/L pH 4.8的醋酸‑醋酸钠缓冲液1mL，发酵上清液1mL(对照管加入灭活的发酵上清液)，并加入6cm长1cm宽的新华滤纸条，滤纸条浸泡于液体中混匀后50℃酶促反应30min。之后，亦用上述DNS法测定还原糖生成量.酶活力单位的定义：以每毫升发酵上清液酶促反应30min释放1μg葡萄糖的量为一个酶活单位(U)。
[0084] 检测结果表明，BJF10菌株发酵1周，每天的上清CMC酶活分别为6.04U/mL，106.80U/mL，180.32U/mL，160.97U/mL，105.44U/mL，84.36U/mL，71.11U/mL(如图9所示)；滤纸酶活每天分别为3.97U/mL，57.19U/mL，81.46U/mL，52.10U/mL，19.06U/mL，13.02U/mL，
14.62U/mL(如图10所示)。BJF10菌株发酵前期纤维素酶活性逐渐升高，3d左右达到峰值随后单位体积发酵上清液的纤维素酶活性呈下降趋势。
[0085] 实施例3、亳菊内生柄孢壳BJF10抗氧化能力的测定
[0086] (1)无菌发酵液的制备
[0087] 菌株的发酵：将PDA平板培养基上的菌落用无菌手术刀切成0.5cm2的琼脂小块，接种至100mL PDB培养基中(250mL锥形瓶)，28℃，120rpm，震荡培养7d；
[0088] 粗样品溶液的提取：用无菌滤纸过滤，滤除菌体，滤液再经0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃存放，得待测发酵液。
[0089] (2)DPPH自由基清除能力的测定
[0090] 精确称取0.00197g DPPH粉末，用无水乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，配制成DPPH母液，4℃避光保存，备用。依次精确量取0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、3.20、4.00m L的DPPH稀释至4.00m L，在517nm下测其吸光度，以无水乙醇作为空白对照,得标准曲线。
[0091] 取三支干燥洁净的试管，编号1，2，3号管；1号管加入2mL DPPH、1mL待测发酵液和2mL无水乙醇，2号管1mL待测发酵液、4mL无水乙醇，3号管2mL DPPH、1mL蒸馏水和2mL无水乙醇；5℃，水浴30min后，以无水乙醇作为空白对照，检测吸光度。
[0092] 配制0.5mg/mL的Vc溶液，代替上述实验中的发酵液作为整体实验对照。
[0093] 自由基清除率按以下公式计算：自由基清除率＝[1‑(A1‑A2)/A3]x100％[0094] A1：1mL待测发酵液+2mL DPPH+2mL无水乙醇
[0095] A2：1mL待测发酵液+4mL无水乙醇
[0096] A3：1mL蒸馏水+2mLDPPH+2mL无水乙醇。
[0097] DPPH标准曲线公式为Y＝9.2956X+0.0043，R2＝0.9996，其中X为DPPH浓度(mmoL/L)，Y为吸光值，如图11所示。
[0098] 根据DPPH标准曲线，将待测发酵液通过DPPH法测定清除率，结果发现待测发酵液对DPPH的平均清除率为67.7％，最高清除率可达73.4％，如表5，相同条件下Vc的清除率如图12、表6所示。
[0099]
[0100]
[0101] 基于其消除自由基的能力，当其与宿主作物共生时，能够增强宿主抗逆性，起到提升作物免疫力的作用。
[0102] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述。然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0103] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
