[0044] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
[0045] 在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0046] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
[0047] 在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0048] 实施例1、(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛的制备
[0049] 取杜仲干燥树皮,浸入饱和NaCl溶液中15分钟,取出晾干,制成小块或小条,150-180℃烘烤4h,粉碎机粉碎,制得盐杜仲粉。取100克盐杜仲粉,加入300ml 60%乙醇室温浸泡10分钟,充分溶胀,60℃水浴30分钟,抽滤漏斗滤纸减压过滤,残渣再一次60℃水浴30分钟,减压过滤,合并滤液。滤液加入到填料为中性氧化铝(100-200目)层析柱中,柱体积为φ60mm×80mm,填料预先用乙醇饱和。收集过柱后的流出液,滤液全部过柱后,在用100ml乙醇洗柱,并收集流出液。使用旋转蒸发仪60℃减压蒸发浓缩,直至剩余100ml左右时结束。分别使用100ml乙醚萃取浓缩液3次,收集合并乙醚萃取液,室温蒸发乙醚。使用30ml 80%甲醇溶解乙醚蒸发后的产物,搅拌,8000rpm离心5分钟,取上清得到杜仲粗提物。先使用制备型色谱柱SHIMADZU PRC-ODS 20×250mm 15μm,流动相为50%甲醇,流速为15ml/min,检测波长315nm,室温操作,收集保留时间为7-8.5分钟的组分(见图1,DZ_2组分)再进行半制备柱HPLC分离,使用色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 9.4×250mm
5μm,流动相为50%甲醇,流速为4ml/min,315nm检测,30℃操作,收集保留时间为5.5-6.0分钟的组分(见图2),得到(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛。质谱图见图3,核磁鉴定图谱见图4和图5。
[0050] 实施例2、(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛诱导bMSCs实验
[0051] 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是细胞成骨分化的标志分子,ALP或OPN的升高提示细胞已经完成了成骨分化的主要阶段。常用RT-PCR、RT-荧光定量PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法检测。
[0052] 1. 大鼠bMSCs培养:
[0053] 1)2月龄SD大鼠(雌雄不拘),颈椎脱臼法处死,浸入70%乙醇消毒5-10分钟。无菌条件下剪开腿部皮肤和肌肉,取股骨和胫腓骨,剔净肌肉,骨两端剪去端部组织,暴露红骨髓。用无菌注射器吸取少许培养基,从骨的一段插入骨髓腔中,冲出骨髓细胞于无菌培
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养皿/培养瓶/培养板中,或用骨钳夹碎骨骼,释放细胞,用培养基调整细胞密度为1×10/ml后,置培养瓶/培养板中,放入37℃,5%CO2培养箱中。48小时后首次换液,之后实时换液;
[0054] 2)细胞生长融合达90%后传代。倾去培养基,PBS洗涤,加入0.25%胰酶,消化数分钟,倾去胰酶,加入培养基吹打,分瓶,补足培养基,放入37℃,5%CO2培养箱中。2-3天后再次传代。
[0055] 培养基组成:DMEM/F12(1:1),含15%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml,适量NaHCO3,pH7.2-7.4。
[0056] 2. (反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛诱导:
[0057] 将bMSCs接种至6孔细胞培养板中培养,培养基血清浓度降为7.5%,并进行实验分组(见下表):
[0058]
[0059] 细胞诱导时间为7天,期间实时换液。
[0060] 3. RNA提取、荧光定量PCR检测成骨标志基因表达:
[0061] 1)RNA提取:
[0062] (1) 将1ml RNAiso Plus试剂加入到6孔培养板中,震荡1分钟,使其裂解培养细胞;
[0063] (2) 将裂解液转移到1.5ml EP管中,加入0.2ml氯仿,震荡,室温静置5分钟;
[0064] (3) 1200rpm离心5分钟,转移上清液至另一1.5ml EP管中(约400ul);
[0065] (4) 加入400ul异丙醇,充分混匀,室温静置10分钟;
[0066] (5) 1200rpm离心5分钟,弃上清;
[0067] (6) 沉淀加入0.5ml 75%乙醇(DEPC水配制),上下颠倒洗涤沉淀;
[0068] (7) 1200rpm离心5分钟,弃上清,室温充分挥发乙醇;
[0069] (8) 加入适量(一般20-50ul)DEPC水,溶解沉淀,-80℃保存。
[0070] 2)逆转录反应:
[0071] (1) 按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。
[0072]
[0073] (2) 37℃ 15 min;85℃ 5 sec,4℃保存
[0074] 3)荧光定量PCR:
[0075] (1) 按下列组份配制PCR反应液(冰上进行):
[0076] SYBR Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl,PCR Forward Primer(10 μM)1μl,PCR Reverse Primer(10μM)1μl,cDNA 2μl,dH2O 8.5μl,总体积25μl。
[0077] ABI 7500 Real-Time PCR需使用ROX Reference Dye II作为内标荧光,每管(1ml) SYBR Premix Ex TaqTM II中加入20μl。
[0078] (2) 反应参数:95℃30秒;95℃5秒→60℃34秒,循环40次;95℃15秒,60℃1分钟(荧光监测点),以1%速率缓慢升至95℃15秒(溶解曲线测定,荧光监测点),60℃1分钟。
[0079] (3) ABI 7500 Software v2.0.4软件设置反应参数,分析采集数据。
[0080] 成骨标志基因选定骨桥蛋白(osteopontin,OPN)。
[0081] 结果见图6,在100μM浓度下,OPN表达较对照高3.82倍。说明(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛能够诱导和调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化,[0082] 实施例3、(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛诱导bMSCs细胞钙化结节[0083] 钙化结节是细胞成骨分化重要的形态学和特异性染色标志物,茜素红S是特异性钙化结节的染色剂。出现钙化结节表明细胞已经进入了成骨分化的末端,已经具有了钙元素的聚集能力,钙化结节数量和体积反映了细胞钙的聚集能力。
[0084] 将bMSCs接种至24孔细胞培养板中培养,1μM、10μM和100μM浓度(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛诱导10天。弃培养液,PBS洗涤细胞2次,4%多聚甲醛固定10min,双蒸水洗涤,茜素红S染色45min,水洗1-2次,晾干镜检。
[0085] 结果见图7,经(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛诱导后,细胞钙化结节形成能力显著提高,尤其是在10μM浓度下更为显著。
[0086] 实施例4、(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛对去势大鼠体重和血清ALP的影响实验
[0087] 去势动物模型是骨质疏松常用的模型,雌性动物去除卵巢后,雌激素分泌水平下降,导致骨质疏松。该模型模拟了人类女性更年期后,因卵巢功能的下降,雌激素分泌的减少而导致的骨质疏松症。动物去势后,伴随着骨质疏松过程,体重往往会增加,这其中的原因之一是干细胞的成脂分化被加强,这不仅体现在骨小梁中出现大量脂肪,也体现在其他组织器官的脂肪积累。因此药物干预后,去势动物体重增加的抑制是骨质疏松症状改善的间接体现。
[0088] 血清ALP是骨质疏松的生化指标,与成骨细胞活性相关,成骨细胞数量和活性较高时,血清ALP会下降,反之亦然。因此该指标与骨质疏松间接相关。阳性对照ALF:阿法骨化醇 (Alfacalcidol,ALF,又称法能)是目前临床上用于治疗骨质疏松症的一种药物,在实验中,能够发挥与ALF类似作用的样品,可在数据统计分析后,判断是否具有干预治疗骨质疏松的作用。
[0089] 1. 实验动物分组和去势动物的制备:
[0090] SD大鼠随机分成4组,每组20只,即假手术组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠,阴性对照、阳性对照和实验组大鼠在无菌环境下打开腹腔,摘除卵巢,腹腔分层缝合,肌注青霉素(2万单位/只)。假手术组大鼠除不摘除卵巢外,手术操作均与其他组相同。
[0091] 2. 实验动物灌胃处理:
[0092] 4组大鼠中,阳性对照组和实验组分别用阿法骨化醇 (Alfacalcidol,ALF) 和(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛灌胃,阳性对照组的灌胃计量为每3粒ALF(0.25ug/粒)灌10只大鼠,实验组灌(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛5μg/只。手术后第10天开始,每天1次,连续灌胃90天。
[0093] 3. 体重和血清ALP测定:
[0094] 各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,称量体重,解剖腹腔心脏采血,凝固后离心制备血清。血清ALP测定采用南京建成生物工程公司试剂盒,具体操作方法为:血清5μl,加缓冲液和基质液各50μl,37℃水浴15分钟,加显色剂150μl,摇匀,520nm测定吸光度。
[0095] 结果:
[0096] 去势大鼠体重和血清ALP显著升高,(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛能够显著抑制(p<0.01)(参见图8)。灌注(反式)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙烯醛去势大鼠的体重较阴性对照下降了10.6%(p<0.01),血清ALP下降了36.7%(p<0.01)。