[0030] 一、制备N‑(N′‑戊烯酰‑苏氨酸酰)‑壳寡糖:
[0031] 1、将119mg苏性氨酸和138mg碳酸钾溶解于水中,在冰水浴条件下滴加120mg戊烯酰氯,滴加完后置于室温下反应,制得N‑戊烯酰‑苏氨酸溶液。
[0032] 2、将N‑戊烯酰‑苏氨酸溶液的pH值用3N盐酸调至中性后与壳寡糖、198mg1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和115mgN‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合进行反应,取得反应液。
[0033] 3、将取得的反应液用透析袋(截止分子量2000)透析3天,透析液经冷冻干燥,得N‑(N′‑戊烯酰‑苏氨酸酰)‑壳寡糖。
[0034] N‑(N′‑戊烯酰‑苏氨酸酰)‑壳寡糖的红外图谱见图1所示。
[0035] 在图1中于3396cm‑1附近的宽峰主要为壳寡糖及苏氨酸残基上羟基上O‑H、酰胺基‑1上N‑H伸缩振动峰,2930cm 附近吸收峰为戊烯酰基上甲基及亚甲基上C‑H键的伸缩振动峰;
‑1 ‑1
1647 cm 、1561 cm 是酰胺基吸收的二重振动峰。
[0036] 二、如图2所示流程制备基于分子印迹传感器:
[0037] 1、热聚合:
[0038] 将3mg 苏丹红‑I和6mgN‑(N′‑戊烯酰‑苏氨酸酰)‑壳寡糖加入5mL由一定体积比的DMF和H2O(1/1)组成的混合溶剂中,室温超声溶解,再加入50mg交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA),1.5mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)。静置12h后,用氮气进行至少10分钟的净化,除去溶解氧,取得混合液。移取5μl混合液滴到洁净的玻碳电极表面,覆盖一块干净的盖玻片。然后置于65℃烘箱中加热12h,除去盖玻片后在玻碳电极表面形成一层透明的聚合物膜。
[0039] 2、分子印迹传感器的制备:
[0040] 将20mgN,N‑亚甲基双丙烯酰胺(MBA)及1.5mg过硫酸铵(APS)溶于3mL一定浓度(0.5M)的醋酸缓冲液(pH6.5)中,将上述聚合膜电极置于此溶液中,在‑1 .4 V 0 .2 V范围~内循环伏安扫描10圈(扫速40 mV/s),制得二次聚合的苏丹红‑I分子印迹膜修饰的玻碳电极。电聚合的循环伏安线图见图3。
[0041] 用含醋酸30%的甲醇溶液作为洗脱液洗脱分子印迹膜中的印迹分子苏丹红‑I,得到分子印迹聚合膜修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定苏丹红‑I的分子印迹传感器。
[0042] 三、修饰的玻碳电极进行扫描电镜表征:
[0043] 修饰的玻碳电极的扫描电镜表征见图4,洁净玻碳电极(对照)、苏丹红‑I洗脱前的分子印迹电极、苏丹红‑I洗脱后的分子印迹电极和重新吸附苏丹红‑I后的分子印迹电极分别在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M 醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0044] 其中曲线a为洁净玻碳电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0045] 曲线b为热聚合后苏丹红‑I分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0046] 曲线c为电化学引发聚合后苏丹红‑I的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0047] 曲线d为洗脱苏丹红‑I后的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0048] 曲线e为重新吸附苏丹红‑I后的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0049] 另,取得重新吸附苏丹红‑I后的分子印迹电极的方法:将苏丹红‑I洗脱后的分子印迹电极浸泡在浓度为0.2M的苏丹红‑I乙醇溶液中吸附苏丹红‑I至饱和。
[0050] 从图4可以修饰膜电极表面具有许多较为微小的表面凹陷,明显增加了膜的表面积,有利于分子印迹膜对模板分子苏丹红‑I的吸附。
[0051] 四、分子印迹传感器用于循环伏安测试:
[0052] 分别将裸玻碳电极、热聚合分子印迹膜修饰的玻碳电极、电化学引发聚合分子印迹膜修饰的玻碳电极、洗脱苏丹红‑I后分子印迹膜修饰玻碳电极、重新吸附为工作电极,参比电极为饱和甘汞电极,辅助电极为铂电极;电解液为含1.0 mmol/L 二茂铁甲醇的0.25M醋酸缓冲液(pH=6.5);扫描电位范围‑0.1~0.5V。
[0053] 循环伏安图见图5所示,其中,曲线f为非分子印迹电极洗脱前在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0054] 曲线g为非分子印迹电极洗脱后在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液(pH6.5)溶液中的循环伏安曲线图。
[0055] 从图5可见,裸玻碳电极的峰电流最大(曲线a),热聚合后在玻碳电极表面形成分子印迹膜致使峰电流有较明显的下降,但依然较大(曲线b),这说明电极表面的膜中有较多的空隙导电;在电化学引发聚合后,伏安曲线的峰电流变得很小,几乎看不出峰形(曲线c),当分子印迹膜修饰电极脱除模板分子后,伏安曲线峰电流明显增加(曲线d),当传感器再次吸附模板分子后,伏安曲线峰电流又有所下降(曲线e)。
[0056] 五、分子印迹传感器对苏丹红‑I的差分脉冲伏安测试:
[0057] 将分子印迹传感器为工作电极,参比电极为饱和甘汞电极,辅助电极为铂电极;电解液为1 .0 mmol/L 二茂铁甲醇的0.25M的醋酸缓冲液(pH= 6.5);扫描电位范围‑0.5~0.4 V;将分子印迹传感器置于电解液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描,结果见图6。由图6可知,传感器对不同浓度的苏丹红‑I具有不同的DPV响应。
[0058] 空白电解液扫描DPV的峰电流I p0 ,然后再将分子印迹传感器置于一定浓度的苏丹红‑I溶液中孵育后,再扫描得到峰电流Ip ,则传感器的响应电流为ΔIp = I p0‑ Ip ,结果见图7。
[0059] 由图7可知,在测定范围内ΔIp值与苏丹红‑I的浓度响应呈线性关系。
[0060] 通过该线性关系即可以样品的传感器的响应电流查找到样品的苏丹红‑I的浓度。