[0028] 下面通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0029] 本发明红嘴相思鸟核基因引物的测序方法，包括如下步骤：
[0030] (1)对红嘴相思鸟进行总基因组的提取，提取方法采用酚、氯仿抽提法，具体步骤如下：
[0031] 1)剪取约100mg肌肉组织样本，剪碎后置于一只已灭菌的2.0ml的EP管；
[0032] 2)在EP管中加入1ml的DNA提取液及4ul 20mg/ml的RNaseA(核糖核酸酶),摇匀后置于37℃水浴锅中水浴1h；
[0033] 3)取出EP管，加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，摇匀后置于50℃水浴锅中水浴约2-3h，直至肌肉完全消化，期间每隔10min上下摇匀；
[0034] 4)取出EP管，待冷却至室温后，加入等体积的饱和酚，温和上下摇匀约7分钟直至水相与酚相混合成乳状液；
[0035] 5)在10000rPm,10℃下离心15min,取出上层水相至另一20mlEP管中；
[0036] 6)重复酚提取一二次；
[0037] 7)加入等体积的CI(氯仿异戊醇)，温和上下摇匀约7min，10000rPm，10℃下离心15min，取出上层水相至另一2.0mlEP管中；
[0038] 8)再次加入等体积的CI，温和上下摇匀约7min,10000rPm,10℃下离心15min，取出上层水相至另一1.5mlEP管中(分装到2管中，每管300ul)
[0039] 9)加入1/5体积的3mol/l NaAC及2倍体积预冷的无水乙醇，室温轻摇EP管置于-20℃冰柜中冷冻3h；
[0040] 10)从冰柜中取出EP管，12000rPm，4℃离心15min,并弃上清；
[0041] 11)加入500ul 75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃离心15min,并弃上清；
[0042] 12)再加入500ul 75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃离心15min,并弃上清，后风干沉淀；
[0043] 13)加入100ul 1*TE溶解DNA；
[0044] 14)取2ulDNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳；
[0045] 15)总DNA置于-40℃冰柜中储存。
[0046] (2)采用核基因rag1三对通用引物对红嘴相思鸟全基因组进行扩增，得到rag1的3个扩增片段，其中：
[0047] 1)采用通用引物第一对primer-F1与primer-R1对红嘴相思鸟全基因组进行扩增，得到扩增片段；
[0048] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,primer-F1(5umol/L)2.2μl,primer-R1(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0049] PCR反应体系为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0050] 2)采用通用引物第二对primer-F2与primer-R2对红嘴相思鸟全基因组进行扩增，得到扩增片段；
[0051] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,primer-F2(5umol/L)2.2μl,primer-R2(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0052] PCR反应体系为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0053] 3)采用通用引物第三对primer-F3与primer-R3对红嘴相思鸟全基因组进行扩增，得到扩增片段；
[0054] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,primer-F3(5umol/L)2.2μl,primer-R3(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0055] PCR反应体系为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0056] (3)分别对三对通用引物所扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，并经过DNA胶回收试剂盒纯化后进行测序，得到三个基因片段。具体操作流程如下：
[0057] 1)柱平衡：向吸附柱CA 2中(吸附柱放入收集管中)加入平衡液BL 500μl，12000rpm离心60秒后，收集管中的废液倒掉，把吸附柱重新放回收集管中；
[0058] 2)切下含单一目的DNA的胶块，放入1.5或2mL的EP管中，并用记号笔作上标记；
[0059] 3)向2)中的EP管加入500μl的溶胶液PN，50℃水浴10min,使胶块溶解；
[0060] 4)将上一步中所得溶液移入柱平衡处理过的CA2中，室温放置2分钟后，12000rpm离心60秒，收集管中的废液倒掉，将吸附柱CA2放回到收集管中；
[0061] 5)向上一步的吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，静置2分钟，12000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放回到收集管中；
[0062] 6)重复上述步骤5)；
[0063] 7)将步骤6)得到的CA2和收集管的组合，12000rpm离心2分钟，尽量出净漂洗液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干，防止残留液对后续实验的影响；
[0064] 8)将步骤7)得到的吸附柱CA2放入一个已灭菌的1.5mL EP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加一定量的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液；
[0065] 9)为了提高DNA的回收量，可将步骤8)得到的DNA溶液重新加入CA2中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，再收集DNA溶液。
[0066] 10)取2μl步骤9)得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，然后贴上标签，置于-40℃冰箱中保存。
[0067] (4)利用Sequencher4.15软件对测序结果进行拼接，得到2700bp的基因片段。
[0068] (5)除去步骤(4)中得到的基因片段两段测序不好的序列，用Oligo7软件进行引物设计，选取匹配性最好的三对引物，包括：
[0069] rag1的第一对上游引物是RAG-F1_17有21个碱基GAAAAAACACCCTCTGAAGAC，下游引物是RAG-R1_533有21个碱基TCTGGTAGTATGRCACACATC；
[0070] rag1的第二对上游引物是RAG-F2_996有21个碱基TGCATGGAAAATATGGCCAAC，下游引物是RAG-R2_2024有22个碱基GCACAAGTTTCTCATCATACCC；
[0071] rag1的第三对上游引物是RAG-F3_1945有21个碱基AGAGGCTATGAAGAACAGTGA，下游引物是RAG-R3_2779有20个碱基CAGACTCATTTCCTTCGCTT；
[0072] (6)用三对特异性引物对红嘴相思鸟全基因组进行扩增并测序，三对引物如下表1所示，
[0073] 表1 三对引物表
[0074]
[0075] 具体扩增、测序步骤过程如下：
[0076] rag1的第一对引物扩增：
[0077] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,RAG-F1_17(5umol/L)2.2μl,RAG-R1_533(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0078] PCR反应程序为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0079] rag1的第二对引物扩增：
[0080] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,RAG-F2_996(5umol/L)2.2μl,RAG-R2_2024(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0081] PCR反应程序为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0082] rag1的第三对引物扩增：
[0083] PCR扩增采用25ul反应体系：10×Ex Taq buffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)2μl,RAG-F3_1945(5umol/L)2.2μl,RAG-R3_2779(5umol/L)2.2μl,TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μl,template 2μl,ddH2O 13.97μl。
[0084] PCR反应程序为：70℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共4个循环；94℃变性20s，55℃退火20s,72℃延伸2min30s,共36个循环；最后再72℃延伸10min。
[0085] 将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并做纯化，最后送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，测序结果经拼接最后得到2725bp长度的序列。
[0086] (7)在设置退火温度为55℃，退火时间为40s的条件下，用三对特异性引物对红嘴相思鸟进行扩增，其它实验步骤按照步骤(6)的方法进行操作。
[0087] (7)利用不同个体的红嘴相思鸟扩增测序并验证步骤(6)中引物的特异性；具体实验步骤按照步骤(6)的方法进行操作。
[0088] 本发明所得到的引物有着非常好的扩增功能，对红嘴相思鸟核基因rag1的扩增最后均能获得明亮的条带，具体如图1所示，自左向右看，最左侧泳道为M泳道，之后依次为泳道1～24，其中泳道1～8是第一对引物RAG-F1_17和RAG-R1_533扩增的条带；泳道9～16是第二对引物RAG-F2_996和RAG-R2_2024扩增的条带；泳道17～24是第三对引物RAG-F3_1945和RAG-R3_2779扩增的条带；泳道M为分子量标记；泳道1～24是红嘴相思鸟的同一个个体，用不同引物扩增出来的条带。本发明通过三对引物的设计，能特异性对红嘴相思鸟核基因rag1进行扩增，且同时用不同个体的红嘴相思鸟进行PCR扩增验证，测序结果最终都能获得核基因rag1序列，证明该方法简单、快速、有效。
[0089] 上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
