菌株P51的降解石油及菲的方法   0    0

[0002] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有石油降解功能的菌株P51以及利用该菌株进行海洋环境治理。

[0003] 随着社会经济的发展，人类对石油的要求不断扩大。石油产品如汽油、柴油、润滑油、石蜡、沥青等逐渐走近人类的生活，随之而来的各类污染事件，也屡见不鲜。2007年11月，装载4700吨重油的俄罗斯油轮“伏尔加石油139号”在刻赤海峡遭遇狂风，解体沉没，3000多吨重油泄漏，致出事海域遭严重污染；2010年4月20日，半潜式钻井平台“深水地平线”发生爆炸，两天后沉入墨西哥湾，每天有约1万吨原油泄漏到墨西哥湾，造成十分严重的石油污染；2010年7月17日,辽宁大连新港附近中石油的一条输油管道发生爆炸起火，虽然历经15个小时扑救，但是该次爆炸却导致了大量原油泄漏入海；2011年6月期间中海油渤海湾一油田发生漏油事故，漏油持续数月，造成的危害无法估计。2013年11月中下旬，位于青岛经济开发区的中石化东黄输油管线发生破裂并发生爆炸，此事件不仅对局部海域造成污染更对当地居民的生命财产安全及生态环境造成了巨大的损失。海上石油井的爆裂、石油管线的破裂所带来的危害，对海洋环境、人类的身体健康和可持续发展产生了直接或间接的影响。据统计，全世界每年约有600～1000万吨石油及其产品流入水体中，而其中又有绝大部分流入海洋。

[0004] 石油污染日益严重，引发了社会各界的关注，石油污染的治理问题，也成为了当今学者首要解决的任务。目前常用的方法有物理处理、化学处理和生物处理。物理处理是通过物理方式将海洋表面的石油进行稀释、聚集、迁移等处理，但是却不能彻底清除海水中溶解的石油；化学处理是向海水中加入某种化学试剂，以此来达到降解目的，但此种方式却会引起二次污染；生物处理则是利用生物修复技术，通过微生物代谢将海洋中的石油污染物进行降解，具有经济效益好、处理效率高及环境污染小优点，能够从根本上解决石油污染的问题。生物修复技术相对于其他处理方法而言，费用较低，经济效益和环效益俱佳，将成为一种解决复杂环境污染问题的有效方法。

[0005] 目前研究表明，能够降解石油的微生物有79个属，共200多种微生物，他们分别属于细菌、放线菌、霉菌、酵母菌以及藻类。其中土壤中最常见的石油降解菌主要有：微杆菌属(Microbacterium)、节核细菌属(Arthrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等，在海洋中最主要的降解菌有：无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)等。

[0006] 目前文献报道较多的微生物治理环境石油污染主要集中在陆地石油污染。例如原晓艳[1]从受石油污染的海水中分离出3株以原油为唯一碳源的菌株，经鉴定3株菌株分别为属于γ-变形菌纲和放线菌纲，其中γ-变形菌纲降解率最高，可达到30.52％。将这三种菌分别两两组合培养时，其组合菌对原油的降解率均高于单独菌株，且不等于各相应单菌的降解率之和。由此可以看出组合菌比单菌能更有效的降解石油烃，各菌株之间由于竞争、拮抗、促进等各种因素的作用，形成了混合菌的降解率。郭倩瑜等[2]通过筛选得到2株优势降油菌，经初步鉴定一株为芽孢杆菌属，另一株为不动杆菌属。并通过改变温度、pH、接种量等不同条件，最终得出两株菌的最优降解条件。王佳楠等[3]从天津大港油田石油污染土壤和渤海海上钻井平台洗油污水中分离出6株石油降解细菌，经鉴定分别属于芽胞杆菌属、假单胞菌属和苍白杆菌属，其中，芽胞杆菌属S3具有最高的烷烃(41.3％)和芳烃(30.9％)降解率。

[0007] 虽然生物法治理石油污染环境已经有了大量的研究，但是目前应用于石油污染处理的降解菌大多数来自于土壤，而来源于海洋习居降解菌报道相对较少。相应于土壤环境而言，海洋环境具有低温、低氧、寡营养的特点，投放高效率降解菌常需要伴随投放营养源等，而外源微生物对土著微生物能否长期保持竞争优势，是否会对土著生物造成威胁，投放营养物质是否会对生态环境造成影响，不少学者对此意见不一。而筛选海洋习居降解菌在很大程度上解决了这些问题。因此，通过筛选海洋微生物来治理海洋石油污染已成为当今研究的方向。

[0008] 为解决现有技术中海洋石油污染处理的问题，发明人经过对石油污染海域筛选获得具有石油降解性能的微生物菌株，确定其分类地位并对其石油降解性能进行评价，同时研究发现，菌株P51在降解石油的同时，还具有降解菲的作用，为降解多环芳烃污染物奠定了基础。

[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0010] 一株具有石油降解功能的菌株P51，拉丁文学名为Tessaracoccusflavescens.其16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。所述的菌株P51采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。

[0011] 所述的菌株P51已提交保藏，具体保藏信息如下：

[0012] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

[0013] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

[0014] 保藏日期：2017年7月12日；

[0015] 保藏编号：CGMCC No.14411；

[0016] 所述的菌株P51的形态及理化特征为：

[0017] 菌株P51在固体LB培养基上在28℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株P51的菌落形态，菌体表面光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，橙黄色。

[0018] 菌株P51菌株呈短杆状，无鞭毛，长约0.74-0.84μm，宽约0.30-0.37μm。

[0019] 所述菌株P51的分离方法包括以下步骤：将菌株P51按照1％的接种量接种至富集8
培养基中，在15℃条件下培养，菌株P51的菌悬液浓度为10cfu/ml，所述的富集培养基组成是：以石油作为唯一碳源添加至无机盐培养基中，石油添加量为无机盐培养基总量的0.5％(v/v)。

[0020] 所述的无机盐培养基组成为：MgSO4·7H2O 0.7g，NH4NO31g，KCl 0.7g，KH2PO42g，Na2HPO43g，天然海水1000mL，PH 7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。

[0021] 本发明第二个目的请求保护上述菌株P51的应用，即以石油降解和菲降解的方式进行石油污染的治理。

[0022] 本发明第三个目的请求保护上述菌株P51降解石油的方法，具体为：

[0023] 将菌悬液浓度为108cfu/ml菌株P51按照1％的接种量接种至富集培养基中，于15℃，150r/min摇床震荡15d。

[0024] 上述菌株P51降解菲的方法为：将菌悬液浓度为108cfu/ml菌株P51按照1％的接种量接种至富集培养基中，于15℃静置培养7d。

[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次从海底沉积物中筛选出一株同时具有石油降解和菲降解的菌株P51。该菌株在15℃摇床震荡15d后，石油降解率可达到28.90％。经GC-MS检测分析，菌株P51在15℃静置培养7d后，对菲的降解率可达到61.60％。
在该菌株筛选过程中发现，菌株P51在降解石油的同时，对多环芳烃中菲也具有较高的降解性，这一特性解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

[0031] 下面结合具体实例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

[0032] 实施例1

[0033] 菌株P51的采集及分离

[0034] 样品采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，采集后冰盒保存，并迅速运回实验室进行石油降解微生物的富集分离。

[0035] 称取约10g新采集的沉积物样品加入到含100mL富集培养基中的250mL三角瓶中，在15℃静置培养条件下富集7d，然后以梯度稀释分离法分离获得石油降解菌株。

[0036] 培养基组成为：

[0037] 无机盐培养基：MgSO4·7H2O 0.7g，NH4NO3 1g，KCl 0.7g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 3g，天然海水1000mL，PH 7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。

[0038] 微量元素混合液：CaCl2 2mg，FeCl3·6H2O 50mg，CuSO4 0.5mg，MnCl2·4H2O 0.5mg，ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000mL。

[0039] 富集培养基：在上述无机盐培养基中，添加石油作为唯一碳源，石油按无机盐培养基总量的1.5％(v/v)添加。

[0040] 分离培养基：在富集培养基中添加1.5％(质量百分比)的琼脂凝固剂。

[0041] 实施例2

[0042] 菌株的形态观察及鉴定：

[0043] 将菌株P51分别在以石油为唯一碳源的富集培养基和LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株P51的菌落形态。同时挑取菌落用2.5％戊二醛溶液固定1-2h，然后将菌悬液滴于硅片上，自然晾至微湿半干状态，再用PH为7.2的磷酸缓冲液冲洗硅片10min，冲洗3次后，分别用30％，50％，70％，85％，95％，100％乙醇梯度脱水，再向硅片滴加醋酸异戊酯进行固定，放置过夜。第二天将制备好的样品镀膜后，进行扫描电子显微镜观察。如图1所示，菌株P51在固体LB培养基上，菌体表面光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，呈橙黄色。如图2所示，菌株P51呈短杆状，无鞭毛，长约0.74-0.84μm，宽约0.30-0.37μm。

[0044] 根据菌株形态和培养特征排除重复菌株，然后将获得的菌株进行16SrRNA基因序列分析。采用微波法提取分离获得的微生物基因组DNA，以细菌通用引物F27:5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'，5'-TACCTTGTTACGAC TT-3'(上海生工合成)，进行PCR扩增，PCR扩增产物的测序结果提交到VCBI的GeneBank数据库进行比对分析，并利用Blast软件和MEGA软件构建获得的微生物菌株系统发育树，进行可培养微生物种群多样性分析。如图3所示为菌株P51的16S rRNA序列分析，结合其形态结构观察，鉴定菌株P51为Tessaracoccus flavescens。

[0045] 实施例3

[0046] 菌株P51石油降解性能的测定

[0047] 菌株P51石油降解性能评价采用紫外分光分度法测定菌株的石油降解率。以萃取出的石油醚混合物为样品，使用U-5100型紫外分光分度计对菌株降解前后的石油含量变化进行分析。菌株对石油的降解率计算公式为：η＝(n0-n1)/n0×100％，其中η为石油降解率，n0为空白对照，n1为接种了菌株的培养液的萃取液中残余的石油含量。

[0048] 在富集培养基加入150μL石油作为唯一碳源进行菌株石油降解性能分析。将菌株(菌悬液浓度为108cfu/ml)按照1％的接种量接种至含100ml富集培养基中，分别在15℃静置和150r/min摇床震荡15d后，以300ml石油醚进行萃取，采用GC-MS法测定萃取液中石油烃各组分的降解情况。以未加微生物菌株的富集培养基作为对照，实验重复3次。

[0049] 在15℃摇床培养条件下，菌株P51对石油的降解率最高，15d可达48.90％；15℃静置培养条件下，菌株P51的降解率则明显低于摇床培养，15d降解率仅为41.32％。说明菌株P51对石油的降解在振荡培养时，其降解能力明显高于静置培养，氧气在石油的降解中十分必要。

[0050] 实施例4

[0051] 菌株P51菲降解性能的测定

[0052] 菌株P51菲降解性能评价采用气相色谱法测定菌株的石油降解率。以萃取出的二氯甲烷混合物为样品，使用GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪对菌株降解前后的菲的含量变化进行分析。色谱柱型号为HP-5MS(30m×0.25nm×0.25μm)，进样量为1μL。菌株对菲的降解率计算公式为：η＝(n0-n1)/n0×100％，其中η为菲的降解率，n0为空白对照组的峰面积，n1为接种菌株的实验组峰面积。

[0053] 向富集培养基中加入150μL石油作为唯一碳源进行菌株石油降解性能分析。将菌株(菌悬液浓度为108cfu/ml)按照1％的接种量接种至含100ml富集培养基中，分别在15℃静置和150r/min摇床震荡7d后，以30ml二氯甲烷进行萃取，采用GC-MS法测定萃取液中菲的降解情况。以未加微生物菌株的富集培养基作为对照，实验重复3次。

[0054] GC-MS分析菲的色谱条件为：进样口温度200℃；载气为氦气，柱箱初始温度为40℃，升温程序设定为40℃保持5min，之后以10.00℃/min的速度升温至230℃，保持17min；离子源温度为230℃，扫描范围为50-600amu。

[0055] 在15℃静置条件下培养时，菌株P51对菲的降解率最高，7d可达61.60％；15℃摇床培养条件下，菌株P51的降解率则明显低于静置培养，7d降解率仅为52.62％。说明菌株P51对菲的降解在低氧培养时，其降解能力明显高于好氧震荡培养，因此，该菌株适用于海底低温低氧环境的菲降解。

[0056] 通过对菌株P51对石油以及菲的降解性能评价，发现菌株P51对石油以及菲都具有较好的降解性能。其中，在15℃摇床条件下培养15d，菌株P51对石油的降解率为28.90％；在15℃静置条件下培养7d，菌株P51对菲的降解率为61.60％。

[0057] 参考文献

[0058] [1]原晓艳海岸带石油降解菌的分离及多样性分析[D].山东：青岛理工大学,2015:46-47

[0059] [2]郭倩瑜,张建民,李蓉蓉,含油废水处理中石油降解菌的筛选及其降解条件优化[J].纺织高校基础科学学报,2016,29(2):269-274

[0060] [3]王佳楠,石妍云,郑力燕,石油降解菌的分离鉴定及4株芽胞杆菌种间效应[J].环境科学,2016,36(6):2245-2251.

[0061] 序列表

[0062] SEQ ID No.1(菌株P51(Tessaracoccus flavescens)的16S rRNA序列)：

[0063] CGGGTGTTACCGACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGCCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTCTGAGATTCGCTCACCCTCACAGGCTCGCAGCTCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCAATGAGTCCCCGGCATTACCCGCTGGCAACATTGGACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTATACCGACCAAAAAGGGGCACCTATCTCTAGATGTTTCCGGCATATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGGCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGTACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGAGAACGTGGAATGTCCCCCACACCTAGTACCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAGCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCTTCTCAGCGTCAGGAAAGGTCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTCCACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCTTCCTCAAGTCTGCCCGTATCGGAAGCAGGCTCAGTGTTGAGCACTGAGTTTTCACTCCCGACGTGACAAACCGCCTACAAGCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTATCACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTCCCACTACCGTCACGTTAGCTTCGTCATGGGTGAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCGCACGCGGCGTTGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCATGACCGCCGGAGCTTTCCAACCCCAAACATGAGTCCAGGGTTCATATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAGATGTTATCCCAGAGTCAAGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCGTG

[0026] 图1为菌株P51的菌落形态照片；

[0027] 图2为菌株P51的菌体形态照片；

[0028] 图3为菌株P5116SrRNA系统发育树；

[0029] 图4为菌株P51对石油的降解照片；

[0030] 图5为菌株P51对菲的降解照片。