[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时‑电流传感器及其应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时‑电流传感器及其应用,具体步骤如下:
[0007] (1)乙酰基抗体‑金钯纳米花/石墨烯复合材料(AbAc‑AuPd@GO)的制备
[0008] 将0.1~1g石墨烯(GO)分散在10~30mL去离子水超声0.1~1h,再加入1~5mL 0.1~3g/L的氯金酸(HAuCl4)溶液和1~5mL 0.1~3g/L的氯钯酸(H2PdCl4)溶液,磁力均匀搅拌0.1~1h,置于氙弧灯下照射0.1~1h,再转入干燥箱中,30~100℃反应10~36h。最后,将样本置于氢气管式炉中100~500℃反应0.5~5h。将制备的AuPd@GO分散在去离子水中得到
0.1~5mg/mL的AuPd@GO分散液,备用。
[0009] 取1~300μL 0.1~5g/L乙酰基抗体(AbAc)置于氦氖激光治疗仪中照射5~60s,再添加到0.1~3mL上述AuPd@GO分散液中,30~42℃反应1~8h。
[0010] (2)组蛋白乙酰转移酶计时‑电流传感器的制备
[0011] a.Au
[0012] 金电极(Au)使用前分别用直径为0.1~0.5μm和0.01~0.1μm的Al2O3粉末进行打磨,利用超纯水通过超声清洗1~5次,之后置于氮气流中干燥,再将其浸泡于0.01~0.5M H2SO4溶液中,在(‑0.1~0.5)V~(+0.5~1.5)V范围内进行循环伏安扫描5~30min,最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。
[0013] b.peptide/Au
[0014] 将5~20μL 0.01~1mM底物多肽(peptide)滴涂于处理好的Au表面反应1~8h,通过Au‑S键固定的底物多肽自组装单分子层,随后蒸馏水缓缓冲洗电极,再滴涂5~20μL组蛋白乙酰转移酶反应液【HATp300(200~1000nM,1~5μL)与乙酰辅酶A(1~5mM,1~5μL)在磷酸缓冲溶液(PBS)中充分混合】,将电极置于25~37℃恒温箱中孵育30~120min。
[0015] c.AbAc‑AuPd@GO/peptide/Au
[0016] 取(1)中制备的AbAc‑AuPd@GO溶液2~12μL滴涂于peptide/Au电极上,30~42℃下静置10~60min,随后蒸馏水缓缓冲洗电极,之后用于计时‑电流检测。
[0017] 在电极制备过程的乙酰化反应中,改变p300浓度,探究其对电化学信号的影响。所述的电化学参数条件如下:计时‑电流法,电压:‑0.3V;时间:100s。实验中用到的磷酸缓冲溶液(PBS)(O.1M,pH 7.0),通过0.1M的磷酸二氢钠和0.1M的磷酸氢二钠进行配置,调节体积比来控制pH,作为电解质溶液时,含有5mM的双氧水溶液。
[0018] 发明原理:利用上述基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时‑电流传感器及其应用,基于乙酰基抗体‑金钯纳米花/石墨烯复合材料,利用计时‑电流法构建了一种新型的无酶电化学传感器,用于检测组蛋白乙酰转移酶活性。首先将底物多肽利用Au‑S作用固定于金电极表面,再将乙酰化反应液滴涂于电极表面进行乙酰化反应,将乙酰辅酶A上的乙酰基转移至底物多肽的特定赖氨酸残基上,生成乙酰化多肽,再在电极表面滴入具有较强的催化能力乙酰基抗体‑金钯纳米花/石墨烯复合材料,将制备好的电极置于含有双氧水的电解质溶液中,出现明显的电化学催化信号。乙酰化反应过程中,随着p300浓度变大,被乙酰化的底物多肽变多,可以通过乙酰基和乙酰基抗体的特异性结合作用,增加乙酰基抗体‑金钯纳米花/石墨烯复合材料的负载量。显然,在浓度一定范围内,目标物浓度越大,电流响应越明显。实验结果表明,电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系,实现对目标物的检测。其优点在于:
[0019] (1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学响应对p300浓度对数值的线性相关方程2
为y=10.084lgCp300+40.988,R =0.9889,线性范围为0.001~1000nM,检测限为0.37pM,由此说明传感器对p300可实现高灵敏检测。
[0020] (2)高特异性。常见其他相关酶对本检测体系均无干扰。原因在于:本发明是基于p300催化乙酰化反应将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到底物多肽的赖氨酸残基上,乙酰基的生成影响到乙酰基抗体‑金钯纳米花/石墨烯复合材料的负载量,从而影响电化学信号的生成,其他酶无法催化乙酰化反应,故对本检测体系无干扰。
[0021] (3)结果准确。回收率均在90%~110%之间。
[0022] (4)抑制剂。利用该计时‑电流传感器对双氧水的电化学响应,实现对HATp300抑制剂(如C646)的检测,可以得出传感器的电化学响应与HATp300抑制剂的相关关系。
[0023] (5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。
[0024] 综上所述,本发明制备基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时‑电流传感器及其应用,具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点,可以实现低浓度HATp300的检测及其小分子抑制剂的筛选,具有良好的应用前景。