[0039] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0040] 为探索设施作物的干旱等级判定方法,本发明采用TTC方法测定根系活力,硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定丙二醛(MDA)含量,WP4-T露点水势仪测定叶片水势,综合植株各项生理指标,优化计算参数,确定作物干旱等级。技术方案如下:
[0041] 如图1所示,将处于苗期的植株分别进行不同程度的干旱处理,测定不同处理下植株的叶片水势、根系活力以及丙二醛含量,比较不同处理下测得的参数,建立作物干旱胁迫指数的回归方程,判定花椰菜干旱等级,从而确定花椰菜受灾情况。
[0042] 实施例1
[0043] 第一步:设施作物干旱试验
[0044] 将处于苗期的作物移栽至塑料盆中,试验期间,设置4个水分处理,正常灌溉T1(田间最大持水量的70%~80%)为对照组,轻度胁迫T2(田间最大持水量的60%~70%),中度胁迫T3(田间最大持水量的50%~60%),重度胁迫T4(田间持水量<50%),每个处理设置三盆重复。
[0045] 第二步:仪器设备与药品准备
[0046] (1)仪器设备
[0047] 10-1000μL、1000-5000μL DRAGONLAB可调式移液枪,上海万岛仪器科技有限公司;
[0048] 紫外分光光度计,日本岛津公司;
[0049] WP4-T露点水势仪,北京力高泰科技有限公司;
[0050] 数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;
[0051] 电子天平,奥豪斯仪器(上海)有限公司;
[0052] Sigma台式高速冷冻离心机3K15,北京五洲东方科技发展有限公司;
[0053] 医用低速离心机,江苏正基仪器有限公司。
[0054] (2)药品试剂
[0055] 红四氮唑,分析纯,上海科峰化学试剂有限公司,上海;
[0056] 乙酸乙酯,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0057] 浓硫酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0058] 琥珀酸钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0059] 低亚硫酸钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0060] 磷酸二氢钾,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0061] 十二水合磷酸氢二钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0062] 硫代巴比妥酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0063] 氢氧化钠,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0064] 三氯乙酸,分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司,上海;
[0065] 磷酸氢二钾,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海;
[0066] 石英砂,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,上海。
[0067] 第三步:花椰菜生理指标的测定
[0068] (1)叶片水势的测定
[0069] 采用WP4-T露点水势仪(Decagon Devices,Inc.,USA),设施样品室温度为25℃,样片与样品室温度差<1℃,在上午10:00左右,选取生长良好的新鲜花椰菜功能叶,测定其叶片水势LWP并记录。
[0070] (2)根系活力的测定
[0071] (2-1)取0.4%TTC(红四氮唑)溶液0.2ml放入10ml量瓶中,加少许Na2S2O4粉摇匀后产生红色的TTF(三苯甲腙)。乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、3.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到TTF浓度分别为
0.5%、1%、1.5%、2%、3%的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线;
[0072] (2-2)把根仔细洗净,用吸水纸吸干根部表面水分,称取根样品0.5g,分别放入小烧杯中(空白试验先加入硫酸再加入根样品,其他操作相同),加入0.4%TTC溶液和-10.1mol·L 磷酸缓冲液等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液中,37℃条件下暗处保温1h,此后加入1mol·L-1硫酸2ml,以停止反应;
[0073] (2-3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯(共10ml)和少量石英砂研磨,提取TTC;将红色提取液移入试管中,用分光光度计在485nm下比色,以空白作参比读出光密度,查(2-1)所绘制标准曲线得到四氮唑还原量,再经公式计算得到四氮唑还原强度,公式如下:
[0074]
[0075] 其中:Ra:四氮唑还原强度,MT:四氮唑还原量(μg),M:根重(g),t:保温时间(h);
[0076] Rd=100/Ra (2)
[0077] 其中:Rd为根系伤害力。
[0078] (3)丙二醛MDA含量的测定
[0079] (3-1)取分析纯KH2PO427.216g用蒸馏水定容到1000ml作为A液,另取分析纯K2HPO4·3H2O 45.644g,定容至1000ml,作为B液;取21.25ml的A液+228.25ml的B液混合,用蒸馏水定容至1000ml,得到0.05M磷酸缓冲液(PH7.8);
[0080] (3-2)取0.6g TBA(硫代巴比妥酸),先用少量NaOH溶解,再用10%TCA(三氯乙酸)定容至100ml;(10%TCA:取10gTCA用蒸馏水定容至100ml);
[0081] (3-3)称取0.5g样品放入研钵中,加入5mlPH7.8的磷酸缓冲液,冰浴研磨,匀浆倒入离心管中,冷冻离心20’(转速为4000r/min,4℃),上清液即所得MDA酶液,倒入试管,置于0-4℃下保存待用;
[0082] (3-4)取1mL酶液和2mL 0.6%TBA反应液(含0.6g硫代巴比妥酸,10%三氯乙酸)于离心管中,封口沸水浴15min,迅速冷却,之后进行4000r/min离心10min,取上清液分别在600、532、450nm波长下比色;MDA含量的计算公式如下:
[0083] MDA=(6.45×(D532-D600)-0.56×D450)×0.015/W (3)
[0084] 其中:D600为样品在600nm处的吸光度值,D532为样品在532nm处的吸光度值,D450为样品在450nm处的吸光度值;W为样品重。
[0085] 第四步:设施作物干旱胁迫指数的计算
[0086] 叶片水势LWP是反映植物缺水程度的最灵敏的指标,可以反映土壤—植物—大气系统(SPAC)中水分的流动。MDA是膜脂过氧化分解的主要产物之一,其含量与植物受伤害程度呈正相关。根部是植株吸收土壤水分以及营养元素最重要的通道,根系伤害力Rd则是植株根系受伤害程度,是反映根系生命力的综合指标,根据实验过程中各指标受影响状况,选取叶片水势LWP、丙二醛MDA含量、根系伤害率Rd作为确定花椰菜受灾的判定指标,Q为干旱胁迫指数,综合比较干旱胁迫下各指标变化趋势以及变化程度,计算公式如下:
[0087]
[0088] 其中:Q为干旱胁迫指数,X、Xck分别为干旱组与对照组的叶片水势,Y、Yck为干旱组与对照组的MDA含量,Z、Zck为干旱组与对照组的根系伤害力。
[0089] 第五步:设施作物干旱等级的划分
[0090] 在设施作物适宜生长的水分条件下,作物正常生长,0<Q≤1。当Q值大于1时,作物即受到干旱胁迫,Q值越大,干旱胁迫程度越深。根据Q值的变化,将干旱灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级,设施作物具体的干旱灾害等级划分标准如下表1所示。
[0091] 表1 设施作物干旱胁迫等级划分
[0092]
[0093] 第六步:设施作物干旱等级确定
[0094] 测定设施作物干旱胁迫下的叶片水势LWP、丙二醛MDA含量以及根系伤害率Rd,计算设施作物干旱胁迫指数。
[0095] 实施例2
[0096] 根据实施例1的方法,利用花椰菜进行干旱试验,设置4个水分处理,正常灌溉T1(田间最大持水量的70%~80%),作为对照组,轻度胁迫T2(田间最大持水量的60%~70%),中度胁迫T3(田间最大持水量的50%~60%),重度胁迫T4(田间持水量<50%)。灌溉初期,各处理的10cm处土壤体积含水率分别为:T1为48.5%,T2为32.4%,T3为29.1%,T4为
21.6%。随着灌溉后天数的增加,土壤含水量缓慢下降,在灌溉后第3天,各处理的土壤含水量趋于平稳并且逐渐接近,各处理土壤含水率分别为:T1为25.1%,T2为21.0%,T3为
19.5%,T4为17.9%;试验期间环境温度为23℃/17℃,相对空气湿度为72%,光合有效辐射为800μmol·m-2·s-1。每个处理设置3盆重复。按上述步骤测定生理指标,见表2-1,2-2,2-
3,再根据公式计算出干旱胁迫指数,利用干旱指标判定受灾等级,结果见表3。
[0097] 由表可知在干旱胁迫下,花椰菜叶片水势以及根系活力均出现显著下降,而丙二醛MDA含量则相反出现显著的增加。干旱胁迫指数Q变化与MDA相似,干旱胁迫时间的越长、胁迫程度愈严重,Q值越大。由表3可知,T2处理前9天内,Q<3,属于轻度灾害Ⅰ,当干旱超过9天后,Q明显增大,为中度灾害Ⅱ,当T2处理持续时间超过15天时,为重度灾害Ⅲ;T3处理下,干旱胁迫前期前三天,Q<3,为轻度灾害Ⅰ,干旱超过3天至第9天,为中度灾害Ⅱ,当干旱时间超过9天,Q显著增大,达到重度灾害Ⅲ;T4处理下,前三天为轻度灾害Ⅰ,干旱胁迫6天时,为中度灾害Ⅱ,当胁迫处理9~12天时,为重度灾害Ⅲ,当超过15天时,Q明显增加,为特重度灾害Ⅳ。
[0098] 表2-1 干旱胁迫对花椰菜叶片水势的影响
[0099]
[0100] 表2-2 干旱胁迫对花椰菜根系伤害力的影响
[0101]
[0102] 表2-3 干旱胁迫对花椰菜MDA含量的影响
[0103]
[0104] 表3 干旱胁迫指数随时间的响应
[0105]
[0106]
[0107] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。