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黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2017-01-06

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2017-05-24

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2020-04-21

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2037-01-06

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201710010283.1	申请日	2017-01-06
公开/公告号	CN106591468B	公开/公告日	2020-04-21
授权日	2020-04-21	预估到期日	2037-01-06
申请年	2017年	公开/公告年	2020年
缴费截止日
分类号	C12Q1/6888 、C12Q1/6851 、C12N15/11	主分类号	C12Q1/6888
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	3
权利要求数量	4	非专利引证数量	1
引用专利数量	1	被引证专利数量	0
非专利引证	1、Zirin J等.Drosophila as a modelsystem to study autophagy《.SeminImmunopathol.》.2010,第32卷(第4期),363-372. Zirin J等.Drosophila as a modelsystem to study autophagy《.SeminImmunopathol.》.2010,第32卷(第4期),363-372. 李瑾等.GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒《.病毒学报》.2011,第27卷526-531.;
引用专利	CN103074451B	被引证专利
专利权维持	6	专利申请国编码	CN
专利事件	许可	事务标签	公开、实质审查、授权、实施许可

申请人信息

申请人	杭州电子科技大学	第一申请人	杭州电子科技大学
专利权人	杭州电子科技大学	当前专利权人	杭州电子科技大学
发明人	沈洁	第一发明人	沈洁
地址	浙江省杭州市下沙高教园区2号大街	邮编	310018
申请人数量	1	发明人数量	1
申请人所在省	浙江省	申请人所在市	浙江省杭州市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

杭州君度专利代理事务所

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

杜军

摘要

本发明公开黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法。本发明引物组合物包括10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物。试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品。本发明可同时针对黑腹果蝇10种自噬作用关键基因进行检测，一天内可完成192个样品的检测，既节约生产和检测成本，又提高检测效率；RNA内参提供样品RNA完整性的对照内参，确保检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，使得检测具有更好灵敏度和特异性，从而避免其他检测方法特异性不高的问题。

摘要附图

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2023-01-31	专利实施许可合同备案的生效	IPC(主分类): C12Q 1/6888 合同备案号: X2023980030245 专利申请号: 201710010283.1 申请日: 2017.01.06 让与人: 杭州电子科技大学受让人: 杭州电子科技大学绍兴柯桥智慧农业研究院有限公司发明名称: 黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法申请公布日: 2017.04.26 授权公告日: 2020.04.21 许可种类: 普通许可备案日期: 2023.01.09
2	2020-04-21	授权
3	2017-05-24	实质审查的生效	IPC(主分类): C12Q 1/68 专利申请号: 201710010283.1 申请日: 2017.01.06
4	2017-04-26	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于包括黑腹果蝇中自噬作用关键基因与RNA内参的RT PCR扩增引物和PCR扩增引物；其中RT PCR扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21，PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22。

2.如权利要求1所述的黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于黑腹果蝇中自噬作用关键基因包括Atg3，Atg4，Atg5，Atg7，Atg8，Atg10，Atg12，Atg16。

3.黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，其特征在于包括DEPC水、5×RT PCR缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；
所述的反转录引物如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；
所述的PCR引物如权利要求1所述的PCT扩增引物；
所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列如SEQ ID NO.23，反向扩增引物序列如SEQ ID NO.24，其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。

4.如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤（1）、采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；
步骤（2）、以核酸为模板进行RT PCR反应
取5-30ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水 8μL，5×RT PCR 缓冲液 4μL，RT PCR引物溶液 2μL，RT PCR酶 1μL 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录，反应条件：48℃ 1分钟，
42℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃直至收取 RT PCR 产物，其中反转录引物溶液中各RT PCR引物浓度均为300nM，所述的RT PCR引物为如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；
步骤（3）、以反转录产物为模板进行 PCR 反应
取RT PCR产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL， DNA聚合酶 1.4μL，Z溶液 2μL 混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃ 2分钟；
94℃ 30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列如SEQ ID NO.23，反向扩增引物序列如SEQ ID NO.24，其中通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物为如权利要求1所述的PCR扩增引物；
步骤（4）、GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.2-1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL， DNA标准品 0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其应用，尤其是涉及一种黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。人们早就知道自噬作用的存在，但是只有在2016年度诺贝尔生理学与医学奖获奖者日本科学家大隅良典开拓性的研究之后，人们才意识到它的机制、懂得了它的重要性。
目前，研究已经发现，自噬作用作为细胞中的清洁工，能够吞掉病原体，参与免疫反应；遭到扰乱的自噬过程与帕金森氏病、癌症、遗传病、2型糖尿病和老年人体内其他疾病都有所关联。深入了解和控制自噬作用，对于治疗疾病甚至延缓衰老进程，都具有重大意义。

[0003] 黑腹果蝇是科学家们最为青睐的模式生物之一。黑腹果蝇具有生活史短，易饲养，繁殖快，染色体少，突变型多，个体小、易于观察等特点，被广泛用于遗传学的研究、发育中的基因调控的研究、各类神经疾病的研究、帕金森氏病、阿尔兹海默老年痴呆症、药物成瘾、酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆、认知行为的研究等。在黑腹果蝇中，存在和人类基因保守一致的自噬作用基因，包括Atg3，Atg4，Atg5，Atg7，Atg8，Atg10，Atg12，Atg16。由于发达的遗传学研究已经让科学家能自由“改造”果蝇的基因和神经元，同时黑腹果蝇中自噬基因和人类基因的一致性，目前以黑腹果蝇为模型自噬作用相关的机制研究正在广泛的开展。

[0004] 目前已有的检测黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平的方法包括实时荧光定量PCR,RNA测序、基因芯片、荧光原位杂交等技术。

[0005] (1)目前最常用的方法是实时荧光定量PCR。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，但也存在如下缺点：1)通量低：如果只用一种荧光标记，一次只能检测一个基因。当一个样品同时需要检测多种基因时，必须一个一个检测，成本相对增高，效率低，周期长，对大批量的样品更是无从下手。2)成本相对较高：如需要同时检测多个基因，就需要采用多种荧光标记；目前最多共同使用4到5种荧光标记，用于标记每个待检测基因片段，因此采用多种荧光标记成本相对较高。

[0006] (2)RNA测序作为一种较新的技术，具有灵敏性高、通量高的优点，但是成本昂贵。

[0007] (3)基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于芯片，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。具有高通量的优点，但是技术成本昂贵、复杂，探针的合成与固定比较复杂，不能精确定量，重复性差，灵敏度较低。

[0008] (4)荧光原位杂交方法是将荧光标记的基因探针原位杂交到细胞内核酸上，通过荧光显微镜来检测亮度定量基因表达水平，存在通量低、灵敏度较低、成本高的缺点。

[0009] GenomeLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述几种检测方法存在的缺陷，具有以下优点：1、高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，可以实现单个反应同时检测多达30-40个基因，可同时做192个反应。2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强：可精确定量基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。

发明内容

[0010] 本发明的一个目的是提供黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物，包括10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物；其中RT扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21，PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22。

[0011] 本发明的另一个目的是提供黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，包括如下：

[0012] DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；

[0013] 所述的反转录引物包括以下表1和表2中10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物，基因序列如下表2所示；

[0014] 所述的PCR引物包括表1和表2中10种自噬作用关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。10种自噬作用关键基因的特征峰值见表3。

[0015] 表1 10种自噬作用关键基因与RNA内参的扩增引物

[0016]

[0017]

[0018] 表2扩增引物基因序列

[0019]

[0020]

[0021] 表3自噬作用关键基因特征峰位置

[0022]

[0023] 所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.23；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID NO.24，其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。

[0024] 所述的阳性对照品为连接有设计上述10种基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。

[0025] 本发明的又一个目的是提供上述黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：

[0026] 步骤(1)、采集样本并提取核酸

[0027] 采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；

[0028] 步骤(2)、以核酸为模板进行RT反应

[0029] 取5-30ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48℃1分钟，42℃60分钟，95℃5分钟，4℃直至收取RT产物，其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为300nM，所述的RT引物包括10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物，基因序列如表1和表2所示；

[0030] 步骤(3)、以反转录产物为模板进行PCR反应

[0031] 取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，Z溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃2分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物包括10种自噬作用关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如表1和表2所示。

[0032] 步骤(4)、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

[0033] 取PCR产物0.2-1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比。

[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0035] 本发明所设计的特异性扩增引物，可以同时针对黑腹果蝇10种自噬作用关键基因进行检测，一天之内可完成192个样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；RNA内参，提供了样品RNA完整性的对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，并监控反应效率，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。

[0036] 综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测黑腹果蝇中10种自噬作用关键基因表达水平的试剂盒及其检测方法，可以同时针对10种自噬作用关键基因进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，将为研究机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。

实施方案

[0039] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0040] 实施例1：

[0041] 本发明为一种黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，该试剂盒中包括以下试剂：

[0042] 1)DEPC水

[0043] 2)5×RT缓冲液

[0044] 3)反转录引物(RT primer mix)

[0045] 4)RT酶(全称反转录酶)

[0046] 5)溶液Z

[0047] 6)10×PCR缓冲液

[0048] 7)PCR引物

[0049] 8)25mM氯化镁溶液

[0050] 9)DNA聚合酶

[0051] 10)阳性对照

[0052] 上述的反转录引物包括表1和表2中10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表1和表2中10种自噬作用关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。

[0053] 上述Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

[0054] 上述阳性对照品为连接有设计上述10种自噬作用关键基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。

[0055] 上述基因靶位点设计：选择对黑腹果蝇该基因特异、且针对该基因各个mRNA亚型(transcript variant)之间的保守区域基因片段设计引物，即能够特异性检测该基因的各个mRNA亚型，而不出现非特异性检测到其他基因。

[0056] (1)黑腹果蝇基因Autophagy-related 3(Atg3)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg3基因唯一1个mRNA亚型(transcript variant)。

[0057] (2)黑腹果蝇基因Autophagy-related 4a(Atg4a)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg4a基因2个mRNA亚型(transcript variant)，且2个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0058] (3)黑腹果蝇基因Autophagy-related 4b(Atg4b)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg4b基因唯一1个mRNA亚型(transcript variant)。

[0059] (4)黑腹果蝇基因Autophagy-related 5(Atg5)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg5基因唯一1个mRNA亚型(transcript variant)。

[0060] (5)黑腹果蝇基因Autophagy-related 7(Atg7)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg7基因2个mRNA亚型(transcript variant)，且2个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0061] (6)黑腹果蝇基因Autophagy-related 8a(Atg8a)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg8a基因3个mRNA亚型(transcript variant)，且3个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0062] (7)黑腹果蝇基因Autophagy-related 8b(Atg8b)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg8b基因2个mRNA亚型(transcript variant)，且2个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0063] (8)黑腹果蝇基因Autophagy-related 10(Atg10)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg10基因2个mRNA亚型(transcript variant)，且2个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0064] (9)黑腹果蝇基因Autophagy-related 12(Atg12)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg12基因唯一1个mRNA亚型(transcript variant)。

[0065] (10)黑腹果蝇基因Autophagy-related 16(Atg16)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Atg16基因4个mRNA亚型(transcript variant)，且4个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

[0066] (8)RNA内参：选用黑腹果蝇RpL32(ribosomal protein L32)基因，可检测样品中RNA的完整性。

[0067] 实施例2：

[0068] 本发明一种黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，检测的基因包括黑腹果蝇基因Atg3，Atg4a，Atg4b，Atg5，Atg7，Atg8a，Atg8b,Atg10，Atg12，Atg16(见表1)。采集黑腹果蝇样品，提取核酸，以样品核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

[0069] 1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；

[0070] 2、采集样本并提取核酸

[0071] 采集黑腹果蝇的实验组及对照组样本，分离提取核酸；

[0072] 3、以样品核酸为模板进行反转录(RT)反应

[0073] 1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板见表4)：

[0074] 表4 RT反应试剂和样品混合比例

[0075]

[0076] 注：在RT反应中加入阳性对照品，阳性对照品为由各目标基因克隆所得，包含目标片段质粒，用量为1μL/反应。

[0077] 2)混匀后按以下温度孵育(见表5)：

[0078] 表5 RT反应条件

[0079]

[0080] 4、以反转录产物为模板进行PCR反应

[0081] 1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板见表6)：

[0082] 表6 PCR反应试剂和样品混合比例

[0083]

[0084] 注：Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

[0085] 2)混匀后按以下温度进行热循环反应(见表7)：

[0086] 表7 PCR反应条件

[0087]

[0088] 5、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

[0089] 1)制备GeXP样品(见表8)：

[0090] 表8 GeXP样品混合比例

[0091]

[0092] 2)毛细电泳分离样品

[0093] 将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。

[0094] 6、结果分析(见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书)

[0095] 根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断自噬作用关键基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比(表9)。对照组图谱如图1所示，实验组对照组图谱如图2所示。对照组孵化后70天的成年老年黑腹果蝇，实验组为孵化后10天的成年年轻黑腹果蝇，比较显示，年轻果蝇(图2)相对年老果蝇(图1)，自噬作用关键基因表达水平明显要高，也就是说，老年果蝇中自噬作用基因表达降低了，说明自噬作用随着年龄的增长而逐步丧失功能，可能会导致有害物质大量累积，最终引发衰老和死亡。其结果能准确检测出10种黑腹果蝇中自噬作用关键基因靶标的表达水平，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。

[0096] 表9自噬作用关键基因表达的变化

[0097]

[0098] 实施例3：检测试剂盒灵敏度、特异性分析

[0099] 灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。灵敏度达45拷贝。

[0100] 特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。

[0101] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

附图说明

[0037] 图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果对照组图谱；

[0038] 图2为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果实验组组图谱。

1黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法 2黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法