一种水稻RH4基因及其运用   0    0

[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种参与类黄酮的水稻基因以及该基因在颖壳颜色及混播制种方面的应用。

[0002] 水稻是世界主要粮食作物，也是我国最重要的粮食作物之一。全世界有50％以上、我国有65％以上的人口以稻米为主食。而杂交水稻的推广应用成为世界粮食增长的助推器，从而杂交水稻制种全程机械化的实现也将成为21世纪稻米产业中首要的攻坚项目。杂交水稻的成功应用是育种技术、制种技术和种植推广技术紧密结合、高度配套的结果，对确保我国粮食安全发挥了重要作用。杂交稻的制种就是杂交稻种子生产的过程，加强杂交稻制种技术的创新研究是巩固我国现有杂交水稻育种成果，综合提升我国杂交水稻产业竞争力的必然要求。目前，我国杂交稻制种采取以父母本分播、分植和分收的“分播制种”模式，劳力成本过高、生产效率偏低；而“混播制种”是先将父母本混播、混收后再分离杂交种，这种方式能大幅度减少劳力投入，提高制种效率和效益，代表了杂交稻制种的必然发展趋势，也是杂交水稻种业竞争的技术关键点。

[0003] 为了确保在“混播制种”中高效地清除“父本”而保留“杂交种”，一般要求父本具有雌性不育特性或者父母本携带可区分的形态学特征或生化性状。目前，利用特异性遗传资源构建的雄性不育母本/雌性不育父本、小粒母本/大粒父本以及抗除草剂母本/感除草剂父本等模式基本上解决了从混收种中分离“父本”与“杂交种”的问题，但是这些方式所存在的雌性不育败育不彻底、小粒不育系的异交结实率不高以及外源除草剂基因的可能安全隐患等潜在问题亦不容忽视。为此，寻求一些隐性遗传、表型稳定的特异型颖壳色泽基因可能是实现“混播制种”的理想选择。

[0004] 隐性红颖资源RH4基因的发现解决了“混播制种”的关键技术难题，加强RH4颖壳色泽形成机理的研究对于挖掘和利用RH4应用潜力具有极大意义。申请人获得了一份隐性红颖突变体rh4。rh4的红颖表型非常直观而且稳定遗传，自抽穗至成熟都表现出了明显的红颖表型，对光照、温度和养分等环境因子高度钝感，没有发现对生长发育不利的影响。为探讨这一资源的混播制种利用潜力，从2012年起申请人针对性地选择生育期相近、光温及养分敏感性相似的rh4红颖恢复系与非红颖不育系搭配进行混播制种试验，经对播种期、群体密度、父母本比例及色选方式等重要参数的优化研究，形成了一套高产高效的混播制种技术；2015年，经专家现场鉴定，红颖恢复系与正常黄颖不育系采取混播制种所获得的不育系异交结实率高达61.2％，杂交种子实收产量比常规制种产量提高了13.78‑19.24％，杂交种的色选分辨率达到了99.8％，表明RH4基因具有极大的混播制种应用潜力。通过图位克隆的方法，我们获得了RH4基因，并且发现其参与水稻类黄酮的生物合成。

[0005] 目前，国内外已鉴定了10个异常有色颖壳材料，即5个金黄色颖壳突变体gh1(Nagao，1963)、gh2(Zhang，2006)、gh3(Iwata，1971)、gh5(李亮杰，2008)和gh6(李秋圆，2012)，3个互为等位基因的褐色颖壳基因突变体ibf1(Cui，2007)、ibf1‑1(Shao，2012)、bh6(徐霞，2015；Xu，2016)，1个紫黑稻以及2个等位基因突变的黑色颖壳野生稻bh4(Zhu，2011)和bh4‑(t)(邓伟，2010)。金黄色颖壳突变体表型为颖壳和茎秆积累金黄色色素，gh1是由于类黄酮合成途径中查尔酮合成异构酶(CHI)突变所致，gh2是由于木质素合成途径中肉桂醇脱氢酶(CAD)突变所致，其他突变体并未得到克隆。褐色颖壳突变体ibf1等是由于OsFBX310(Os09g12150)突变所致，其颖壳表现为褐色。而黑色颖壳突变体bh4是由于Os04g0460000突变所致，但其为显性遗传，不适合混播制种。申请人所获得的红颖突变体rh4仅颖壳沟壑有红色明显积累，紫黑色突变体在叶片、茎秆和整个颖壳等均有色素沉积，而金黄色颖壳突变体在茎秆和整个颖壳，褐色突变体在整个颖壳均有色素沉积。因而本课题组所获得的rh4的光合效率高于其他颖壳突变体，更适合混播制种。rh4是对现有有色资源的补充，其受隐性单基因控制，精细定位于在第12染色体前臂，并克隆获得了该基因RH4，对rh4及其转育材料多年的观察发现RH4基因对植株生长发育无不利影响。

[0006] 本发明在国内外未见报道，所在课题组也未公开发表涉及本发明内容的文章，本发明在国内外公众未知。

[0007] 本发明的目的是提供一种水稻基因，该基因参与类黄酮生物合成，使水稻自抽穗至成熟都表现出了明显的红颖表型，命名为RED HULL 4(RH4)。

[0008] 从http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml网站上下载LOC_Os12g10880基因组核苷酸序列，设计引物80FP(AACTTAATTAAGCAAGCAGACGACG)、80RP(GCCAAGAGGATGC CACTTTTCAA)(由武汉擎科合成)，先恢207基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR程序：98℃，3min；30个循环(98℃，10s；55℃，15s；68℃，40s)；68℃，5min。产物测序，得到基因RH4的基因组核苷酸序列。它由469个核苷酸组成，所示的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。抽取抽穗10d的颖壳RNA，反转录成cDNA，用引物CDS‑80‑F1(ATGGTGGCGCTCATCAGG)、CDS‑80‑R1(TCATGGACGACCACCTCCG)进行聚合酶链式反应，PCR产物测序得到RH4的编码序列(CDS)，PCR程序：98℃，3min；30个循环(98℃，10s；55℃，15s；68℃，
30s)；68℃，5min。产物测序，得到基因RH4的编码核苷酸序列,由192个碱基组成，其序列为核苷酸序列为SEQID No.3所示，利用(http://web.expasy.org/translate/)对编码序列CDS进行氨基酸翻译，获得RH4的氨基酸序列，编码64个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

[0009] 进一步的，以ubi启动子驱动，将RH4基因的cDNA序列插入到真核表达载体中获得，真核表达载体为pSB130。

[0010] 作为优选，重组质粒中插入的基因为RH4，但不限于该基因的单表达，也适用于含有该基因的双元或多元表达重组质粒。

[0011] 对于本领域技术人员来说，将本发明基因作为分子探针也属于本发明保护的范围。

[0012] 本发明的有益技术效果是：

[0013] 1、本发明水稻基因RH4调控水稻颖壳颜色，参与水稻类黄酮的生物合成，但不影响水稻的株高、一次枝梗、穗长、穗重、结实率，适用于混播制种。

[0014] 2、本发明所产生的材料由于转入的遗传片段和基因均来源于水稻，能够直接应用于水稻育种。

[0015] 3、本发明基因编码序列短，易于克隆和基因工程操作。

[0016] 4、本发明基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

[0027] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028] 本发明实施例中的引物均由武汉擎科和上海生工合成，序列测序由铂尚生物完成，RNA抽提，PCR及试剂配方参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。

[0029] 实施例1：

[0030] 基因RH4的克隆：

[0031] 从http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml网站上下载LOC_Os12g10880基因组核苷酸序列，设计引物80FP(AACTTAATTAAGCAAGCAGACGACG)、80RP(GCCAAGAGGATGCCACTTTTCAA)(由武汉擎科合成)，先恢207基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR程序：98℃，3min；30个循环(98℃，10s；55℃，15s；68℃，40s)；68℃，
5min。产物测序，得到基因RH4的基因组核苷酸序列。它由469个核苷酸组成，所示的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。抽取抽穗10d的颖壳RNA，反转录成cDNA，用引物CDS‑80‑F1(ATGGTGGCGCTCATCAGG)、CDS‑80‑R1(TCATGGACGACCACCTCCG)进行聚合酶链式反应，PCR产物测序得到RH4的编码序列(CDS)，PCR程序：98℃，3min；30个循环(98℃，10s；55℃，15s；68℃，
30s)；68℃，5min。产物测序，得到基因RH4的编码核苷酸序列。由192个碱基组成，其序列为核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，利用(http://web.expasy.org/translate/)对编码序列CDS进行氨基酸翻译，获得RH4的氨基酸序列，编码64个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

[0032] 实施例2：

[0033] 重组载体的构建和转化农杆菌的建立：

[0034] 根据图1的技术路线，抽取抽穗10d的颖壳RNA，反转录成cDNA，用引物CDS‑80‑PstI‑F1(AACTGCAGAACCAATGCATTG GATGGTGGCGCTCATCAGG)、CDS‑80‑BamHI‑R1(CGGGATCCCGTCATGGACGA CCACCTCCG)进行聚合酶链式反应，PCR产物测序得到RH4的编码序列(CDS)，PCR程序：98℃，3min；30个循环(98℃，10s；55℃，15s；68℃，30s)；68℃，5min。产物测序，得到基因RH4的编码核苷酸序列，序列为SEQ ID No.4所示。将目标片段先用PstI和BamHI酶切，分离回收目标产物(图2)，与PstI和BamHI酶切过的pSB130‑Ubi用T4连接酶连接形成过表达载体。上述引物由上海生工合成，限制性内切酶(BamHI和PstI)和T4连接酶均购于Takara公司；

[0035] 将过表达载体转化农杆菌EHA105(Takara公司产品)中，命名为EHA105‑pSB130‑Ubi‑RH4。

[0036] 实施例3：

[0037] 农杆菌介导的遗传转化：此过程由武汉伯远生物完成，转化的水稻品系为G4(rh4突变体)。

[0038] 实施例4：

[0039] 过表达RH4基因的转基因单株的获得：

[0040] 由实施例3得到的T0代EHA105‑pSB130‑Ubi‑RH4转基因过表达植株共20株，分别命名为RH4‑1至RH4‑20，用T0代转基因叶片抽取DNA，利用Ubi启动子序列与RH4序列设计引物(Ubi‑F：GGTTTGGTTTGCCCTTTTCC，RH4‑R：ATTCCTGGCTCTTGATTTGA)进行PCR阳性检测，PCR程序为94℃预变性3分钟；30个循环(94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒)，72℃延伸5分钟，1.5％的琼脂糖跑胶检测，RH4‑1至RH4‑4能扩出893bp左右的条带单株为阳性单株(图3‑A)。抽提RH4‑1至RH4‑4的单株颖壳RNA，反转录成cDNA，并进行实时荧光定量PCR(realtime‑PCR)检测RH4的表达量(图3‑B)，RH4‑1至RH4‑4表达量显著性上调，收获RH4‑1至RH4‑4的单株自交种，表型如图4所示。

[0041] 实施例5：

[0042] RH4基因参与类黄酮的生物合成

[0043] 抽提G4(rh4突变体)和先恢207抽穗10d后的颖壳花青素与总黄酮，抽提方法参照文献(徐霞，中国水稻科学，2015)，发现rh4突变体中花青素与总黄酮均显著高于野生型(图5)。

[0044] 抽提G4(rh4突变体)和先恢207抽穗10d后的颖壳RNA，反转录成cDNA，并进行实时荧光定量PCR(realtime‑PCR)检测类黄酮途径中关键结构基因的表达量(图6)，发现黄酮途径中关键结构基因表达量显著上下调，提示RH4参与类黄酮的生物合成。

[0045] 实施例6：

[0046] G4、G15(rh4突变体)在混播制种中的应用

[0047] 以正常颖壳颜色的光温敏雄性不育系为父本(P88S、Y58S)、红颖恢复系(G4、G15)为母本，进行杂交，通过混播(parental lines’direct seedling in mixed，DSM)与移栽(parental lines’separate seedling andtransplanting，SST)等方式生产杂交稻种子。本试验于2015年和2016年在长沙春华试验田基地进行(生育期见图7)。色选机为安科公司设计的CF1，选择“灰度杂质A‑红选亮”模式分选出杂交稻种子，从杂物口获得了红颖种子，从净样口中分离出了谷黄色杂交稻种子，其一次色选率达到了99.93％‑99.95％，经对净样口出来的样品进行二次色选后将不再掺杂红颖种子，其色选率达到了100％(色选效果见图
8)，符合商业用种子的纯度要求；并对杂交稻种子进行了产量等评估,发现两年的试验结果P88S/G4和Y58S/G15混播制种(DSM)产量均比移栽制种(SST)分别高出了12.11％和7.23％(产量评估见图9)。这表明将rh4作为色选标记应用于混播制种理论上是完全可行的。

[0048] 本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

[0049] 最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

[0050]

[0051]

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0018] 图1是RH4基因过表达真核重组质粒pSB130‑Ubi‑RH4的构建示意图；

[0019] 图2是重组质粒pSB130‑Ubi‑RH4酶切鉴定图；图中，从左至右第1泳道为DNA分子标记(M1)，Trans 15K，第2泳道为DNA分子标记(M2)，Trans 100bp plus，第3泳道为pSB130‑Ubi‑RH4质粒条带，第4泳道为pSB130‑Ubi‑RH4质粒Pst I、BamH I双酶切结果；

[0020] 图3是RH4过表达转基因植株鉴定结果。A：转基因水稻植株中利用Ubi启动子序列与RH4序列设计引物所获得的PCR扩增结果。图中，“M”代表DNA分子标记，Trans 100bp plus；“‑”代表阴性对照，PCR模板为rh4突变体(G4)植株基因组DNA；“+”代表阳性对照，PCR模板为重组质粒pSB130‑Ubi‑RH4；“1‑4”依次代表4个独立转基因株系RH4‑1、RH4‑2、RH4‑3和RH4‑4，PCR模板依次为各自的基因组DNA。B：从左至右依次为：rh4突变体(G4)、4个独立转基因株系(RH4‑1～RH4‑4)正常生长条件下(28℃，16h光/8h暗)颖壳中RH4的表达水平；

[0021] 图4为RH4转基因材料与rh4突变体的表型图。A是转基因株系RH4‑1的种子；B是rh4突变体(G4)的种子；

[0022] 图5是rh4突变体(G4)与野生型材料WT(先恢207)颖壳中总黄酮与花青素含量的比较；

[0023] 图6是类黄酮途径中关键结构基因在rh4突变体与野生型材料颖壳WT(先恢207)中的表达情况；

[0024] 图7是混直播制种中各组合的生育期观察。SST(parental lines’separately seedling and transplanting)是指父母本分别播种与移栽的模式，DSM(parental lines’direct seedling in mixed)指父母本混直播的模式。

[0025] 图8是杂交种子分选效果图。A是Y58S/G15杂交种子的分选效果版图(依次是Y58S/G15混直播现场图、色选机CF1、混收种子、第一次色选后的杂交种子)，B是P88S/G4与Y58S/G15的分选率结果。

[0026] 图9是P88S/G4与Y58S/G15的DSM与SST模式的产量与产量性状图，依次为异交结实率、千粒重、总穗粒数、每穗粒数、理论产量和实际产量。