[0019] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0020] 生物材料来源
[0021] Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5,中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。
[0022] 实施例1：具有冷适应性的褐藻胶裂解酶AlgL23基因的获得
[0023] 将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD600为1‑1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA。
[0024] 上述人工海水培养基配置方法如下：
[0025] 人工海水培养基：牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl37.51g、KCl 1.03g、CaCl2 1.61g、MgCl2·6H2O 6.4g、NaHCO3 0.15g、MgSO4·7H2O 4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。
[0026] 以Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：
[0027] 正向引物AlgL23‑F：
[0028] 5’‑CGCGGATCCATGATGAATTTATCTCGAAG‑3’；SEQ ID NO:3；
[0029] 反向引物AlgL23‑R：
[0030] 5’‑CCGGAATTCCTCCTGAGTATTCTTCAACG‑3’；SEQ ID NO:4。
[0031] 正向引物AlgL23‑F下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI，反向引物AlgL23‑R下划线标注的是限制性内切酶EcoR I位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS购自中国大连TaKaRa生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。
[0032] PCR反应系统为：
[0033]
[0034]
[0035] PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；55℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。
[0036] 得到PCR产物即为褐藻胶裂解酶AlgL23基因。
[0037] 实施例2：序列分析
[0038] 利用NCBI的BLAST程序在GenBank数据库中进行核酸序列及氨基酸序列的同源性搜索，利用SMART数据库的信号肽预测工具SignalP4.0预测褐藻胶裂解酶是否存在信号肽，利用ExPASy的protparam工具预测蛋白质的理化性质。
[0039] 用上述生物学软件分析的结果显示，基因AlgL23编码区长2223bp，核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。褐藻胶裂解酶AlgL23基因共含有740个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。用ExPASy的protparam工具进行分析，显示蛋白质AlgL23的理论分子量约为82.59kDa，理论等电点为6.55。信号肽分析结果显示，其N端有1‑28个氨基酸为信号肽序列。
[0040] SEQ ID NO：1如下所示：
[0041] ATGATGAATTTATCTCGAAGCAAAACATATTTTAAAACAGCCGGCGTAACTGCAGCCTTGTTATTATCTTTAAATGCACATGCTGTGCATCCTAATTTGGTAATCACTAACGACGATGTACAACACATGCGTCAAGCTATTAGCACTAACAGCGAGAGCCAATTTGCTACAGCGTTTGAGTCATTAAAAGCGCAGGTAGATGAGCAAATAGCACAACCTATCACTGTACCAGTTCCAAAAGATGGTGGTGGTGGTTATACCCATGAACGCCATAAAAAAAATTACCAACTGATGTACAACGCGGGCGTTATTTATCAGCTAAGTAAAGATGAAAAATACGCAAATTATGTTCGCGATATGCTACTTGCATACGCACAGTTATACCCAACGCTTGATGTACATCCAAAGCGTAAAGTGAAATCGCAAAACCCAGGTAAACTTTTTTGGCAAAGCCTGAATGAAGCTATGTGGCTTGTATACACTATTCAAGCATATGACCTAGTACATGACACGCTAAGCGCTGCGAATATAAAAACTATCGAAGATGATTTATTGCGCCCGGTTTCATTATTTATGTCTGAAGGGCAACCTTCTACGTTTAATAAAGTACACAACCATGGGACATGGGCTACAGCTGGTGTTGGTATGGCTGGTTATGTATTAGACGAGCCAGAGTGGGTAGAGAAATCATTATTTGATTTAAAAAAGTCGGGTAAGGGTGGTTTTGTTAAGCAGCTCGAAATGCTGTTTTCTCCCCAAGGCTATTACAATGAAGGGCCTTACTATCAACGTTTTGCATTATTACCATTTGTAACGTTTGCTAAAGCGATTGAAAACAACGAACCTCAAAGAAAGATATTTGAATACCGCGATGGCATATTATTAAAAGCAATCGATACGACTATTCAGCTTAGTTATAACGGTTTGTTTTTTCCTATAAACGATGCCATAAAAAGTAAAGGTATTGACACTATAGAGCTTGTGCAAGGGGTTACTGCGGCTTACGGTTTAACAAATGATGCGGGCTATTTAGATGTAGCTAAAAAGCAAAATCAAATTGTTTTAACGGGTGATGGCTTAAAAGTTGCTCAAGCTTTGGATAAAAGCCAAGAAAAGCCATACGTATTTAAATCCGTTGCTTTTGGTGATGGTAACGATGGTAAGCAAGGCGCTTTGGTTGTTATGCGCAGTGACGTAGGTGGCGATCAAGCATTGCTATTTAAACCTGCCGCACAAGGTTTAGGCCATGGTCATTTTGATAAGCTTACATGGCAGTTTTACGATCATGGTAATGAAATCGTATCTGATTACGGCGCTGCACGCTTTTTAAATGTAGAAGCTAAATATGGTGGTCGTTACTTACCTGAAAACGAGACTTATGCAAAGCATACAGTTGCACACAACACCGTTGTTGTTGATGAAACCACGCACTTTAATGCAAATGTTGAAGTGGGTAATAATAACCACCCAACGCTTAATTTTTTCGAAACCAATCAATACGGTACAGTATCAAGTGGGCAAATAAAAACAGCTTATAAAGGTGTTGAGTTAGAGCGTACTTTAGCGCTTGTTAACCTGCCAGAGCTTGACAGTACCATTGCTGTAGATATGTTTAATGTAACTGCAAATAAGGCACATCAGCTTGATTTACCGCTACATTATAAAGGTCAGTTAATTGATACAAGTTTTGAATTAACAGGTAACGCTAAGCAGTTATCAGCATTGGGTGATAAAAACGGATACCAGCATTTATGGCTTAAGGCACAGGCAAAACCTGAGCAAGGGCTAGCTAAGGTAACGTGGTTAAATGATAACGGACGTTTTTATACACAAACTAGTTTAGTTAAAGGAGATGAGTCGTTCCTATTTACTCAAATAGGCGCAAACGACCCGCACTTTAATTTACGTAACGAAAACGGTTTTATTCGCCGAGTAGATAGCGCTAAACAGCATAAGTTTATATCTATTTTAGAGCCGCATGGCGAGTACAACCCAAGTAAAGAATATACGCTAGAAGCAAATAGCAGAGTAACGGCACTTAACTACAGCGAACAAGATACGCTTACACTTGTTAATGTTGATATTAAGGGCAAATCTTATTTAGTTGCGATCAATAAAGCTGCACAAGCAAACCCTAGCAAGCACACTTTCACATATCAAAATAAAGCATTCACCTTAAATGGCCGTCTTGGCGTTTATGCGTTGAAGAATACTCAGGAGTAA[0042] SEQ ID NO：2如下所示：
[0043] MMNLSRSKTYFKTAGVTAALLLSLNAHAVHPNLVITNDDVQHMRQAISTNSESQFATAFESLKAQVDEQIAQPITVPVPKDGGGGYTHERHKKNYQLMYNAGVIYQLSKDEKYANYVRDMLLAYAQLYPTLDVHPKRKVKSQNPGKLFWQSLNEAMWLVYTIQAYDLVHDTLSAANIKTIEDDLLRPVSLFMSEGQPSTFNKVHNHGTWATAGVGMAGYVLDEPEWVEKSLFDLKKSGKGGFVKQLEMLFSPQGYYNEGPYYQRFALLPFVTFAKAIENNEPQRKIFEYRDGILLKAIDTTIQLSYNGLFFPINDAIKSKGIDTIELVQGVTAAYGLTNDAGYLDVAKKQNQIVLTGDGLKVAQALDKSQEKPYVFKSVAFGDGNDGKQGALVVMRSDVGGDQALLFKPAAQGLGHGHFDKLTWQFYDHGNEIVSDYGAARFLNVEAKYGGRYLPENETYAKHTVAHNTVVVDETTHFNANVEVGNNNHPTLNFFETNQYGTVSSGQIKTAYKGVELERTLALVNLPELDSTIAVDMFNVTANKAHQLDLPLHYKGQLIDTSFELTGNAKQLSALGDKNGYQHLWLKAQAKPEQGLAKVTWLNDNGRFYTQTSLVKGDESFLFTQIGANDPHFNLRNENGFIRRVDSAKQHKFISILEPHGEYNPSKEYTLEANSRVTALNYSEQDTLTLVNVDIKGKSYLVAINKAAQANPSKHTFTYQNKAFTLNGRLGVYALKNTQE。
[0044] 实施例3：基因AlgL23在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的中的重组表达和纯化[0045] 将实施例所得的PCR产物及pET‑28a质粒用限制性内切酶EcoR I和BamHI双酶切，回收酶切后的产物片段。限制性内切酶EcoR I和BamHI购自中国大连TaKaRa生物公司，酶切用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。将经过EcoRI和BamHI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET‑28a质粒载体，在T4 DNA连接酶的催化下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，培养12h，用正向引物AlgL23‑F和反向引物AlgL23‑R进行菌液PCR验证。正确的命名为重组质粒pET‑28a‑AlgL23。
[0046] 接着将重组质粒pET‑28a‑AlgL23转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min,培养12h，用正向引物AlgL23‑F和反向引物AlgL23‑R进行菌液PCR验证，结果得到大小约为2200bp的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确。将重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，结果表明，在pET‑28a的EcoR I和BamHI酶切位点插入SEQ ID NO：1所示的基因AlgL23，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET‑28a‑AlgL23。使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组褐藻胶裂解酶的诱导表达。加入异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6500rpm离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/LNaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni‑NTA Agarose混匀，4℃结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化的蛋白经的SDS‑PAGE电泳分析，其分子量约为83kDa，使用Bradford法测定蛋白浓度，得到浓度约为1.0mg/ml的重组褐藻胶裂解酶(结果参见图1)在图1中，M为蛋白Marker，泳道1为空载体pET‑28a在E.coliBL21中的表达，泳道2为重组载体pET‑28a‑AlgL23在E.coli BL21中的诱导表达，泳道3‑6为经Ni‑NTA纯化所得的目的蛋白AlgL23(82.59kDa)。从图1中可以看出，目的蛋白AlgL23被诱导出来，同时经过Ni‑NTA纯化后，纯度较高。
[0047] 实施例4：重组褐藻胶裂解酶的酶学性质分析
[0048] 1.重组酶活力的测定：
[0049] 将200μL实施例3所得的纯化后的重组海藻多糖裂解酶与800μL海藻酸钠(0.5％，pH8.0)混合，在35℃反应60min后于沸水浴中终止反应，然后加入1mL DNS溶液(DNS溶液配方为：称取3，5‑二硝基水杨酸10g，置于600ml水中，逐渐加入氢氧化钠10，在50℃水浴中搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200g，苯酚2g和无水亚硫酸钠5g，全部溶解澄清后冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤，贮存于棕色试剂瓶中，避光放置7天后使用。)并于沸水浴中反应10min，在540nm下测定吸光值。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μg还原糖(比如褐藻胶寡糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
[0050] 2.温度对酶活性及稳定性的影响
[0051] 在反应温度为4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下反应后测定重组褐藻胶裂解酶酶活，以最高酶活为100％。测定重组褐藻胶裂解酶温度稳定性时，酶液在30℃、35℃、40℃下分别处理0‑180min，在最适反应温度下测定剩余酶活，以未处理时的酶活为100％。最适温度测定结果如图2所示：褐藻胶裂解酶AlgL23在35℃时达到最大活力，表明褐藻胶裂解酶AlgL23的最适反应温度为35℃，在4℃时酶活依旧有最大酶活的48％，表明该酶可以较低的温度下进行反应，具有较为优良的冷适应性。温度稳定性结果如图3所示，该酶在30℃和35℃下较稳定，在温浴2h后依旧有60％的酶活力保留，在40℃温浴1h，酶活力依旧有最初的50％。
[0052] 3、pH值对酶活性及稳定性的影响
[0053] 用不同pH的缓冲体系配制底物，在最适反应温度下测定酶活，以最高酶活100％。缓冲液体系分别为50mmol/L的乙酸‑乙酸钠(pH 4‑6)、磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠(pH 6‑8)、Tris‑Hcl(pH8‑9)甘氨酸‑NaOH(pH9‑10)。pH稳定性的研究是通过将酶液与不同pH的缓冲液等比例混合后，并在4℃放置2h，然后测定剩余酶活力，以未处理时酶活力为100％。结果如图4所示，在pH6.0时重组褐藻胶裂解酶的活力最高，表明褐藻胶裂解酶AlgL23的最适pH为
6.0。pH稳定性结果如图5所示，重组褐藻胶裂解酶AlgL23在酸性(5‑7)范围内相对稳定，4℃处理2h后仍能保持55％以上的酶活力。
[0054] 4、金属离子对酶活性的影响
[0055] 在酶液中分别添加终浓度为1mmol/L或10mmol/L的不同金属离子(Mg2+、Sr2+、Mn2+、2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+
Fe 、Ba 、Cd 、Fe 、Ca 、Cu )，37℃放置1h后，测定酶的剩余活力，以未添加金属离子的酶
2+
活力为100％，研究金属离子对酶活性的影响。如图6所示，结果表明，金属离子Mn 在浓度为
3+
1mmol/L和10mmol/L时都对AlgL23有明显的促进作用，Fe 在浓度为1mmol/时对酶活有轻微
2+ 2+ 2+
的促进作用，当浓度增加到10mmol/L反而对酶活产生了极大的抑制作用。Cu 、Mg 、Sr 、
2+ 2+ 2+
Ca 、Ba 对AlgL23都有不同程度的抑制作用。当浓度为10mmol/L时，Cu 对酶活力产生非常强的抑制作用，几乎完全抑制酶活。
[0056] 5、抑制剂和去垢剂对酶活性的影响
[0057] 在酶液中分别添加终浓度为1mmol/L或10mmol/L抑制剂(EDTA、DTT、巯基乙醇、CTAB、Urea)和1％或10％(V/V)去垢剂(SDS、Tween 20、Tween 80、TritonX 100)，37℃放置1h后，测定酶的剩余活力，以未添加抑制剂或去垢剂的酶活力为100％，研究抑制剂和去垢剂对酶活性的影响。结果如图7所示，褐藻胶裂解酶AlgL23对SDS具有很好的抗性，CTAB对AlgL23有极强的抑制作用。在浓度为10mM时，褐藻胶裂解酶AlgL23基本失活。EDTA和吐温80也对AlgL23有明显的抑制作用，极大的抑制了酶的活性。低浓度的尿素对酶活有轻微的抑制，增加浓度时，抑制作用也明显增强。
[0058] 实施例5：重组褐藻胶裂解酶AlgL23作用于海带粉
[0059] 使用蒸馏水将海带片清洗干净之后，室外晾晒1‑2d，然后在烘箱中烘干后，将干燥的样品研磨成粉末，将粉末加入0.05mol/L的Tris‑Hcl(pH8.0)缓冲液中,50℃搅拌10min制成5mg/ml的底物，20ml底物中加入10U的重组褐藻胶裂解酶AlgL23，在35℃下进行酶促反应，每隔1h取样。所取样品沸水浴10min终止反应，然后4℃，12000rpm下离心20min，使用DNS法测定上清液中还原糖的含量。反应6h后向反应混合物中补加5U的重组褐藻胶裂解酶AlgL23，每隔2h取一次样，反应进行到12h后，还原糖的含量基本不再增加其量达到约为12.5mg(如图8所示)，这些结果表明重组褐藻胶裂解酶AlgL23可以作用于海带产生还原糖。
[0060] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
[0061]
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