[0023] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0024] 本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
[0025] 本发明采用的技术方案如下：
[0026] 一种表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
[0027] S1：将一定量O‑羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0028] S2：采用纺丝液进行静电纺丝，得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0029] S3：将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化；
[0030] S4：将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子EGF的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应；
[0031] S5：将完成接枝反应的纳米纤维离心冻干。
[0032] 步骤S1中，所用O‑羧甲基壳聚糖的规格为粘均分子量5.0×105，脱乙酰度优选为6
80～85％，更优选为80％。所用聚氧化乙烯的规格为平均分子量1.0×10。O‑羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L，O‑羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比优选为1:1～4，更优选为1:3。
[0033] 步骤S2中，静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压优选为12～20KV，更优选为15KV，距离优选为7～10cm，更优选为8cm，进样速率优选为0.3～1.0ml/h，更优选为0.5ml/h，温度优选为25～35℃，更优选为30℃。
[0034] 步骤S3中，洗涤终点pH为7，烘干的温度优选为37～45℃，更优选为37℃，烘干时间优选为2～4h，更优选为4h。等离子体处理的条件为：气体优选采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率优选为250～300W，更优选为280W，压强优选为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间优选为10～15min，更优选为15min。
[0035] 步骤S4中，所述的表皮生长因子EGF的浓度优选为40～80mg/L，更优选为80mg/L，CoCl2的浓度优选为0.15～0.30g/L，更优选为0.20g/L。接枝反应的浸泡浴比优选为1:100～300，更优选为1:200，浸泡温度优选为0～4℃，更优选为4℃，浸泡时间优选为12～24h，更优选为24h。负压闪爆的真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar。
[0036] 步骤S5中，冻干的温度优选为‑30～‑20℃，更优选为‑30℃，真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar，冻干时间优选为3～5d，更优选为4d。
[0037] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0038] 实施例1：
[0039] 1、将0.5gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0040] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0041] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0042] 4、将得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF和0.20g/L CoCl2的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0043] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。
[0044] 实施例2：
[0045] 1、将0.5gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为85％)和0.5g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0046] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压12KV，距离7cm，进样速率0.3ml/h，温度25℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0047] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，45℃烘2h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氮气，处理功率为250W，压强50Pa，处理时间为10min；
[0048] 4、将得到的纳米纤维浸泡在含有40mg/LEGF和0.15g/L CoCl2的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.100mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:100，浸泡温度为0℃，浸泡时间为12h；
[0049] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑20℃，真空度为0.100mBar，冻干时间为3d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。
[0050] 实施例3：
[0051] 1、将0.6gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80％)和2.4g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0052] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压20KV，距离10cm，进样速率1.0ml/h，温度35℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0053] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为300W，压强60Pa，处理时间为15min；
[0054] 4、将得到的纳米纤维浸泡在含有40mg/LEGF和0.30g/L CoCl2的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:300，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0055] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为5d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。
[0056] 对比例1：
[0057] 1、将0.5gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0058] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0059] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0060] 4、将得到的纳米纤维浸泡在DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为
24h；
[0061] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体处理的纳米纤维。
[0062] 对比例2：
[0063] 1、将0.5gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0064] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0065] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为
280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0066] 4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF的DMEM培养基中，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0067] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子的纳米纤维。
[0068] 对比例3：
[0069] 1、将0.5gO‑羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化6
乙烯(平均分子量1.0×10)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0070] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0071] 3、将O‑羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h；
[0072] 4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0073] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种表面接枝重组表皮生长因子的纳米纤维。
[0074] 将本发明实施例与对比例的纳米纤维贴于24孔培养板孔底，每孔加入1ml DMEM培3
养基，按4×10个/孔接种量接入大鼠肺上皮细胞，37℃，5％CO2浓度培养24h，显微镜下观察细胞生长并计数。不同实施例和对比例的细胞生长情况观察结果如图1所示。图1是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的生长情况，图中，A为实施例1处理结果，B为实施例2处理结果，C为实施例3处理结果，D为对比例1处理结果，E为对比例2处理结果，F为对比例3处理结果。不同实施例和对比例的细胞生长增值情况如图2所示。图2是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的细胞增殖率。图中，A为实施例1处理结果，B为实施例2处理结果，C为实施例3处理结果，D为对比例1处理结果，E为对比例2处理结果，F为对比例3处理结果。图1和图2表明本发明实施例方法与对比例相比能够显著促进大鼠肺上皮细胞的生长与增殖。
[0075] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
