稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法及用途   0    0

[0001] 本发明涉及一种真菌孢子萌发液提取物及其用途，特别是一种用于防治稻瘟病的提取物及其用途。

[0002] 稻瘟病是分布最广泛、危害最严重的植物真菌病害之一，几乎所有水稻栽培地区都有该病害的发生。明朝宋应星在1637年所著《天工开物》一书中最早描述了稻瘟病发生的现象。稻瘟病菌则于1881年由加瓦纳在意大利命名，白井于1896年在日本对其予以描述。Herbert首次报道从血马唐(Digitaria sanguinalis)上分离的灰梨孢Pyricularia grisea(Cooke)Sacc在人工培养条件下能相互交配，产生有性态Magnaporthe grisea(Herbert)Barr.。病害流行年份，一般减产10％-20％，重的可达40％-50％，特别重的田块甚至颗粒无收。

[0003] 稻瘟病的防治措施主要有选育抗病品种、药剂防治和栽培措施。其中抗病品种多是基于“基因对基因”学说基础上的垂直抗性品种，而稻瘟病菌的遗传变异十分频繁，单一抗病品种的长期大面积使用极易使其生理小种组成和结构发生改变，从而导致抗病性的丧失。进年来培育成功的很多超级稻品种都高感稻瘟病，大面积推广以后，会使得稻瘟病的防治工作更为复杂，更困难。化学防治具有经济、高效、方便、迅速等优点，一直是稻瘟病综合治理体系中不可缺少的部分，在病害大流行或品种抗病性丧失期间更是最主要的、不可替代的防治手段。在稻瘟病的化学防治上先后使用过以铜和汞制剂为代表的早期重金属化合物、农用抗生素、有机氯、有机磷和烯丙苯噻唑等，这些杀菌剂中的大多数因为毒性和环境毒性的问题，已经被淘汰。

[0004] 三环唑是目前防治稻瘟病的主要药剂，于1976年由Lily公司开发成功，化学名称为5-甲基-1，2，4-三唑并(3，4-b)苯并噻唑，可用于浸根或叶面喷雾处理，从而防治稻瘟病；三环唑的初始作用机制均为抑制病菌中黑色素的生物合成，而使病菌附着胞内的甘油不能积累，从而无法形成足够的渗透压力以驱动侵染钉对寄主角质层的穿透。研究表明，3HNR是三环唑的主要作用靶标，三环唑对3HNR的亲和力要比对4HNR高出200倍。X-射线衍射研究表明，三环唑是3HNR的竞争性抑制剂，占据了由Ser-164、Ile-165、Tyr-178、Met-215、Tyr-216、Cys-220、Tyr-223、Trp-243和Met-283 9个氨基酸组成的直径为 的球形区域，该部位本来是萘酚的结合位点。除抑制黑色素生物合成外，三环唑还具有其他的作用，如对附着胞细胞骨架和附着胞附着能力的影响。对于三环唑防治稻瘟病的作用机制，目前还存在争议，因为抗穿透作用并不能解释所有的问题。三环唑能够抑制多种病原菌的黑色素化，但在生产实践中却只能防治稻瘟病，对同样也以黑色素为致病因子的瓜类炭疽病菌Colletotrichum lagenarium的防治效果并不理想。同时，DHN黑色素合成途径中的聚酮化合物还与许多真菌的其他次级代谢产物有关。此外，与其他黑色素合成抑制剂不同的是三环唑的结构中含有噻唑环，而很多含噻唑环的化合物如烯丙苯噻唑等都具有诱导抗病性的作用。另外，黑色素与致病性间也有复杂的关系。因此三环唑可能存在着其他的作用机制，基于上述原因，Butler等提出了“黑色素合成抑制剂的作用机制可能是揭去了病原菌激发子上的那一层黑色的伪装，从而使得寄主的防卫反应能正常启动”的假说。

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种能用于防治水稻稻瘟病的新杀菌剂----稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法，其依次包括以下步骤：

[0007] 1)、将稻瘟病菌在培养基上于24～26℃黑暗条件下培养9～11d，培养基为：将180～220g土豆和180～220克西红柿进行榨汁处理，在所得的汁液中加入酱油45～
55mL、葡萄糖13～17g和琼脂17～23g，然后用去离子水定容至1L，再经灭菌处理；

[0008] 2)、将步骤1)所得产物于24～26℃在黑光灯下连续照射4.5～5.5d，黑光灯的功率为80～120W，黑光灯与被照射物(即步骤1)所得产物)之间的距离为25～35厘米；

[0009] 接着用质量浓度为0.08～0.12％的吐温-20的无菌水溶液进行清洗，滤纸过滤，得分生孢子悬浮液；

[0010] 3)、在分生孢子悬浮液中加入三环唑(tricyclazole)在24～26℃黑暗条件下培养22～26h，所述分生孢子悬浮液与三环唑的体积/质量比为：80～120L/1g；然后经滤膜过滤，得滤液；

[0011] 4)、将滤液用有机溶剂抽提，所得的有机相旋转蒸发去除有机溶剂后，得固形物，所述固形物为孢子萌发液提取物。

[0012] 作为本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法的改进：步骤4)中的有机溶剂为乙酸乙酯或甲醇，滤液与有机溶剂的体积比为1∶0.8～1.2。

[0013] 作为本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法的进一步改进：步骤3)中经20μm的滤膜过滤，得滤液。

[0014] 作为本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法的进一步改进：步骤1)中的培养基为：将200g土豆和200克西红柿进行榨汁处理，在所得的汁液中加入酱油50mL、葡萄糖15g和琼脂20g，然后用去离子水定容至1L。

[0015] 本发明还同时提供了上述方法制备而得的稻瘟病菌孢子萌发液提取物的用途：用于防治稻瘟病。

[0016] 本发明的发明人在对三环唑防治稻瘟病机制研究的基础上，开发出一种新型的水稻稻瘟病的杀菌剂；该种杀菌剂是在稻瘟病菌分生孢子悬浮液中加入三环唑，经过培养，滤膜过滤，滤液再经过有机溶剂抽提；提取物可以直接作为杀菌剂使用或再和溶剂及助剂等加工成孢子萌发液提取物杀菌剂。

[0017] 本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物可制成乳剂型杀菌剂，每L乳剂型杀菌剂中含有1～100g的提取物。

[0018] 本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物还可制成粉/粒型杀菌剂，该粉/粒型杀菌剂中提取物的重量含量为1％～10％。

[0019] 本发明的杀菌剂在实际使用中，可加工成不同含量和剂型的各种农药制剂，例如乳剂型杀菌剂和粉/粒型杀菌剂。每L乳剂型杀菌剂中含有1～100g的提取物，1％～45％的溶剂(含乳化剂)、1％～20％的助剂，其余为去离子水；上述百分比为体积％。粉/粒型杀菌剂的组分及重量百分含量为：1％～10％的提取物、65％～85％吸附剂或填料和5％～25％的助剂。

[0020] 由于组分含量的不同，乳剂型杀菌剂可分为悬浮剂(SC)、水乳剂(EW)和微乳型(ME)，粉/粒型杀菌剂可分为可湿性粉剂(WP)和水分散粒剂(WG)。上述各种剂型，均是采用常规生产工艺由稻瘟病菌孢子萌发液提取物配置而成，组分中所涉及的乳化剂、溶剂、助剂、吸附剂/填料均为配置农药时所产用的常规品种。例如：乳化剂可选用农乳33#、农乳700#或农乳602#等，溶剂可选用二甲苯、DMF或乙醇，吸附剂/填料可选用硅藻土、白炭黑或珍珠岩等，助剂可选用有机硅、聚乙二醇等。

[0021] 本发明与其它稻瘟病防治药剂相比，具有以下优点：

[0022] 1、本发明的配方产品属高效低毒、低残留、环境相容的农药，符合绿色农产品生产和环境保护的要求。

[0023] 2、本发明产品生产过程中，所使用的三环唑的量远远低于目前生产上直接使用三环唑防治稻瘟病所需的量。

[0024] 3、本发明产品使用方法简单、成本低，农户均能接受。

[0025] 4、本发明对作物安全，防治稻病等的效果好，效果能稳定在75％以上，不容易产生抗药性。

[0026] 本发明的稻瘟病菌孢子萌发液提取物实际田间使用时，每公顷使用提取物5～50克(此数据为孢子萌发液提取物的量，即乳剂型杀菌剂或粉/粒型杀菌剂的有效量)。使用时将本杀菌剂或其制剂用水稀释成有效浓度(稻瘟病菌孢子萌发液提取物的含量)为0.001～5克/L，使用方法均为叶面喷雾。

[0027] 需要重点说明的是：目前，虽然已经有关于三环唑对稻瘟病菌菌丝生长阶段有关黑色素生物合成过程及相关次级代谢物代谢的影响，但还没有有关对孢子萌发过程中物质代谢影响的报道，且在稻瘟病菌的孢子萌发过程中，是没有黑色素生物合成过程及相关代谢活动的。

[0028] 本发明中所使用的稻瘟病菌为公知的常规菌种，例如可购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

[0029] 实施例1、一种稻瘟病菌孢子萌发液提取物的制备方法，依次进行以下步骤：

[0030] 1)、先配制培养基：将200g土豆和200克西红柿进行榨汁处理(仅取用汁液，对残渣作废弃)，在所得的汁液中加入酱油50mL、葡萄糖15g和琼脂20g，然后用去离子水定容至1L。配制完成后，经高压蒸汽灭菌(121℃*20分钟)后，分装至直径9厘米已灭菌的玻璃培养皿，每皿装10～20mL的培养基。待培养基冷却至50℃左右凝固后，在每皿的培养基上接入直径5毫米的稻瘟病菌菌丝块，于25℃黑暗条件下培养10d(天)。

[0031] 2)、然后将步骤1)所得产物于25℃在黑光灯下连续照射5d，黑光灯的功率为100W，黑光灯与被照射物(即步骤1)所得产物)之间的距离为30厘米；

[0032] 接着每个培养皿用质量浓度为0.1％的吐温-20的无菌水溶液(即在吐温-20的无菌水溶液中，吐温-20的质量浓度为0.1％)5ml进行清洗，直径9厘米的定性滤纸过滤，6
得浓度为每毫升10 个孢子的分生孢子悬浮液；

[0033] 3)、按照每100L分生孢子悬浮液投放1g三环唑(tricyclazole)的用量比，在1g三环唑中加入上述步骤2)所得的分生孢子悬浮液，在25℃黑暗条件下培养24h；然后经20μm滤膜过滤，得滤液；

[0034] 4)、将步骤3)所得的滤液用1∶1体积的有机溶剂(乙酸乙酯)进行抽提，静置分层，所得的有机相(位于上层)旋转蒸发去除(完全去除)有机溶剂后，得固形物10g，该固形物为孢子萌发液提取物，其中三环唑的质量含量小于千分之一(固形物中三环唑含量的HPLC分析条件为：C18反相柱，流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速为1mL/s)。

[0035] 实验1、田间药效试验

[0036] 将实施例1所得的孢子萌发液提取物制成杀菌剂，该杀菌剂为悬浮剂(SC)，每L悬浮剂中含有100g的孢子萌发液提取物。具体制备方法如下：称取100g的孢子萌发液提取物(实施例1所得)，加入5mL的丙三醇、70mL的助剂(由甲基萘磺酸钠甲醛缩合物65ml和有机硅消泡剂5ml组成)，加去离子水补足1L。按配方要求，将原药、助剂等充分混合，投入到高剪切均质乳化剂中高速剪切，再泵至砂磨机中砂磨，过滤后即得悬浮剂。此悬浮剂以下简称10％SC。用上述悬浮剂(SC)进行防治稻瘟病的试验。本试验设在杭州市郊区，每2
块试验面积0.30hm，试验对象为生长状况相同的水稻。2009年9月15日喷第一次药，9月
22日喷第二次药，共喷2次。施药量为10％SC每公顷100、200和300mL(即，每公顷使用的孢子萌发液提取物的用量分别为10、20和30g；以制备获得上述孢子萌发液提取物来算，总共所需三环唑的量分别为1g/公顷、2g/公顷和3g/公顷；以孢子萌发液提取物中含三环唑有效成分的量来算的话，三还唑的实际用量分别小于10毫克/公顷、20毫克/公顷和30毫克/公顷)。对照药剂为50％三环唑WP每公顷400g(即，每公顷三环唑有效成分实际用量为200g)。上述药剂均用水稀释800-1500倍，再使用。

[0037] 防治效果见表1。10％SC每公顷100、200和300mL对稻瘟病的防治效果分别为73.9％、80.8％和84.8％，效果优于50％三环唑WP每公顷400g的65.0％。本发明优于对照药剂三环唑，差异显著。

[0038] 表1 10％SC防治稻瘟病病效果

[0039]

[0040] 实验2、田间药效试验

[0041] 将实施例1所得的孢子萌发液提取物制成杀菌剂，该杀菌剂是有效重量含量为1％的水分散粒剂(WDG)，即每KG水分散粒剂中含有10g的孢子萌发液提取物(实施例1所