[0034] 以下实施例中的核酸外切酶Ⅲ购自宝生物工程（大连）有限公司。
[0035] 实施例1 用基于可控自组装镊子结构电化学检测K-ras基因片段
[0036] K-ras原癌基因可以作为分子开关来调节细胞生长，K-ras基因第12密码子突变会扰乱细胞生长并导致癌症，如胰腺癌的恶性肿瘤。统计表明，癌症患者体内K-ras基因发生病变的概率在80%-100%之间。因此，它可以作为胰腺癌早期诊断的生物标志物。
[0037] 以K-ras基因片段作为目标DNA，检测步骤同上所述。
[0038] 目标DNA序列为：5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’。
[0039] 设计镊子结构序列为：
[0040] A1序列为：
[0041] 5’- HS-CCGACCGCAG GATCCTATAA CTTGACGTAG CTAGAAGGAG-3’；
[0042] A2序列为：
[0043] 5’- GCTGGTGGCG TAGGCAAGAT ACATTTTACG CCTGGTGCC-SH -3’；
[0044] A3序列为：
[0045] 5’- GGGTTGGGTT TTTATAGGAT CCTGCGGTCG GAGGCACCAG GCGTAAAATG TATTTGGGTA GGG -3’；
[0046] A1序列的5’端修饰的巯基和A2序列的3’端的巯基用以自组装至金电极表面上。
[0047] 设计发卡结构序列为：
[0048] 5’- TCACTCCTTC TAGCTACGTC AAGGCACTCT TGCCTACGCC ACCAGCTCCA ACTTGTGGTA GTTGGAGCTG GTGGCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACGA -3’；
[0049] （1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、乙醇、超纯水中超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5 M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4 V至+1.5 V，扫描速度100 mV/s，直到获得稳定的循环伏安曲线为止；将电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；
[0050] （2）镊子结构的固定：将合成好的A1、A2、A3序列用10 mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将三条序列用PBS缓冲液稀释；将体系为100 μL、浓度各为0.8 μM的三条序列的溶液放在95℃恒温金属浴中加热5 min，然后室温下反应2 h。之后倒扣到金电极上，反应6h，使镊子结构在金电极表面上形成自组装单分子层；用2 mM 巯基己醇封闭电极4 h；用清洗缓冲液淋洗电极，氮气吹干待用；
[0051] 10 mM PBS缓冲液中含有1 mM Mg2+、1 M NaCl，其pH为7.4；
[0052] （3）镊子结构、目标DNA以及发卡结构之间的杂交反应；将修饰有镊子结构的电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2 h；
[0053] 所述反应体系为：0.6 μM 发卡结构、不同浓度的目标DNA、60 U的核酸外切酶III，及10 mM PBS缓冲液；
[0054] （4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200 μL的G-四链体形成液倒扣在如（3）所述反应后的电极上，室温下30 min；向G-四链体形成液中加入2 μL 20 mM 血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下1 h；用清洗缓冲液冲洗电极，用于电化学检测；
[0055] G-四链体形成液为：10 mmol•L-1 HEPES, 50 mmol•L-1 KCl, pH8.0[0056] （5）电化学检测：采用三电极系统，上述金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；检测所用电解液为含20 mM KCl的pH 7.4，20 mM HEPES缓冲液；先通入氮气30 min；
[0057] 检测方法为差分脉冲伏安法（DPV），扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线。
[0058] 经镊子结构固定至电极、发卡结构与目标DNA之间的杂交及G-四链体-血红素复合物形成后所得到电极为工作电极，用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样的操作和试剂进行反应后，测定目标DNA在不同浓度条件下的DPV曲线图，分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（图2）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10fM到1nM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=2.29471+0.41462logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/μA)，线性相关系数0.99472。目标DNA检测限达到2.5 fM。
[0059] 实施例2. 电化学DNA生物传感器的特异性分析
[0060] 以上述K-ras基因片段为例，用发生单碱基错配和三碱基错配的DNA取代原目标DNA参与杂交反应，具体步骤同实施例1。
[0061] 目标DNA序列为：
[0062] 5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’[0063] 单碱基错配序列为：
[0064] 5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CCCAAG -3’[0065] 三碱基错配序列为：
[0066] 5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC ACAAAG -3’[0067] 比较目标DNA、单碱基错配DNA、三碱基错配DNA三种不同DNA存在下的信号响应。如图4，相比较于完全配对的目标DNA产生的信号增加(a)，单碱基(b)和三碱基错配(c)产生的信号强度要低得多，从而验证了构建的电化学DNA生物传感器能很好地辨别目标DNA和突变序列。
[0068] 实施例3.电化学DNA生物传感器检测血清样品中的K-ras基因片段
[0069] 在实际样品人血清中对一系列浓度的目标DNA进行检测，具体步骤同实施例1。
[0070] 取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样的操作和试剂进行反应后，测定目标DNA在不同浓度条件下的DPV曲线图，分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（图6）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10 fM到1 nM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=1.71005+0.2399logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/μA)，线性相关系数0.9935。目标DNA检测限达到5.1 fM。
